小鼠铁过载模型的建立及其对骨髓造血功能的影响

柴 笑，赵明峰，李德冠，孟娟霞，卢文艺，穆 娟，孟爱民

1天津医科大学 一中心临床学院 天津市第一中心医院血液科，天津300192

2中国医学科学院 北京协和医学院 放射医学研究所放射医学与分子核医学天津市重点实验室，天津300192

铁过载是铁代谢紊乱的疾病。临床上分特发性和继发性，特发性是先天性代谢障碍导致体内铁过度蓄积，为常染色体隐性遗传;继发性血色病常因大量输血、长期内服铁剂、慢性酒癖并摄入含铁饮食或某些血液病等导致。铁过载可引起广泛纤维化及脏器功能损害，严重影响患者生存质量甚至死亡。无论是遗传性的地中海贫血还是获得性的骨髓增生异常综合征，输血依赖的患者都有更高的发病率和死亡率，且与铁过载的程度非常相关，因此铁过载越来越成为临床医生关注的热点［1］。但是由于临床患者个体差异性较大，取材所限，可重复性差，很难深入研究铁过载对骨髓造血功能的作用及机制。本研究探索性地使用动物模型去模拟临床情况，首先建立小鼠铁过载模型，然后检测其骨髓造血功能的变化，为深入研究铁过载对骨髓造血功能的作用及机制提供实验基础。

材料和方法

材料 动物:C57BL/6纯系小鼠40只，雄性，体重20～22 g，购自中国食品药品检定研究院，合格证号:SCXK(京)2009-0017，小鼠饲养于中国医学科学院放射医学研究所SPF级动物房。试剂及仪器:右旋糖酐铁注射液购自丹麦Pharmacosmos厂家，RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物公司，甲基纤维素培养基MethoCult®GF M3434购自StemCell公司，钙荧光素乙酰氧基甲酯 (Calcein-AM)购自美国Sigma公司，16#平头注射器针头，日本Olympus倒置显微镜，美国Beckman Coulter Altra流式细胞仪，日本Sysmex poch100i全自动血细胞分析仪。

分组及处理 使用随机区组法将C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组10只，每次腹腔注射生理盐水0.2 ml;低剂量铁剂组10只，每次腹腔注射质量浓度为12.5 mg/ml的右旋糖酐铁0.2 ml;中剂量铁剂组10只，每次腹腔注射质量浓度为25 mg/ml的右旋糖酐铁0.2 ml;高剂量铁剂组10只，每次腹腔注射质量浓度为50 mg/ml的右旋糖酐铁0.2 ml。每3天注药1次，在给药6周后处死小鼠。

血细胞计数 摘除眼球取血并用K3EDTA抗凝，用全自动血细胞分析仪检测每组10只小鼠的白细胞、血小板、血红蛋白和红细胞。

病理组织学检查 颈部脱臼处死小鼠，取各组小鼠肝脏、脾脏及胸骨。(1)肉眼观察; (2)光镜观察:常规切片，苏木精-伊红染色，400倍镜下观察其病理形态学改变;普鲁士蓝铁染色，油镜下观察骨髓铁的分布情况。

骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMMNCs)分离及计数 无菌剪刀和镊子分离出双侧股骨和胫骨，利用灭菌过的剥骨纸和镊子把小鼠骨头上肌肉剔除干净，用剪刀剪除骨头两端少许，将每只小鼠的单侧股骨放至含1 ml Hank’s液的Ep管中，冲洗骨髓腔，收集单细胞悬液，用全自动血细胞分析仪计数BMMNCs。收集每组小鼠的股骨和胫骨，放入冰上含有7～8 ml Hank’s液的无菌玻璃平皿中，用无菌注射器把骨髓冲入无菌玻璃平皿中，并用注射器反复吹打细胞溶液3次，把骨髓吹打成单细胞悬液。按淋巴细胞分离液∶细胞悬液 =1∶2进行分离，得到的BMMNCs用Hank’s液离心洗涤2次，最后弃去上清，先加入1～2 ml完全培养基 (含20%胎牛血清，1%青霉素、链霉素的RPMI 1640培养基)彻底荡起沉淀，然后加到合适体积后计数，稀释到所需浓度用于以下实验。

BMMNCs内不稳定铁(labile iron pool，LIP)的检测 Calcein-AM是一种膜渗透性螯合剂，它能进入活细胞内被酯酶分解，释放出Calcein发出强绿色荧光。如果细胞存在LIP，LIP能与Calcein可逆性结合，进而淬灭其荧光。本研究用Calcein-AM标记不同处理组细胞，通过检测Calcein的平均荧光强度 (mean fluorescent intensity，MFI)反映细胞内 LIP水平［2］。将各组 BMMNCs浓度调整为 1×106/ml，取 100 μl即1×105个细胞，加20 μl Calcein-AM，37℃避光孵育10 min，用预冷的PBS离心洗涤2次，流式细胞仪检测各组BMMNCs的MFI。

BMMNCs集落培养 收集各组BMMNCs，并将浓度调整为2×105/ml，加200 μl细胞至2 ml M3434，振荡器充分混匀，4℃静置30 min，待气泡消失，用注射器连接16#平头注射器针头，吸取500 μl细胞混悬液，加入24孔板，轻摇培养板，使培养基均匀分布。将培养板放入37℃，5%CO2培养箱中培养7～12 d，于倒置显微镜下进行观察，低倍观察集落形成情况，细胞数≥30为阳性集落，高倍镜下对粒-单系集落形成单位数、红系集落形成单位数、混合系集落形成单位数进行计数。

统计学处理 采用GraphPad Prism 5统计软件进行分析。数据以±s表示，采用t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

铁过载小鼠的一般表现

肤色:与对照组相比，低、中、高剂量铁剂组小鼠在注药第2周时，耳、脚爪、尾巴出现渐深的铁锈色，牙齿呈黄褐色改变，且皮毛开始变得稀疏、粗糙、无光泽，并随着时间的延长和剂量的增加，上述表现更加明显。

行为改变:随着注药时间的延长及累积剂量的增加，低、中、高剂量铁剂组小鼠活动减少，反应迟钝，易受惊吓，出现精神紊乱症状，且高剂量铁剂组小鼠死亡4只。

体重改变:最初各组小鼠体重差异无统计学意义，随着体内累积剂量的增加，低、中、高剂量铁剂组小鼠饮食明显减少，生长缓慢，体重不增或下降，在第6周4组之间差异具有统计学意义 (P＜0.05)(图1)。

小鼠铁过载模型的建立

肝脏HE染色:对照组小鼠肝脏未见明显的病理改变，光镜下细胞排列整齐、形态规则 (图2A);低剂量铁剂组小鼠肝脏肉眼未见明显改变，光镜下肝细胞排列杂乱，可见部分细胞胞浆出现褐色铁沉积 (图2B);中剂量铁剂组小鼠肝脏肉眼可见轻度增大，水肿、淤血，光镜下肝细胞可见团块状褐色铁沉积 (图2C);高剂量铁剂组小鼠肝脏肉眼可见明显淤血，整个肝脏呈深褐色，光镜下肝细胞凝固性坏死，核固缩、溶解，胞浆内满布铁颗粒 (图2D)。

图1 各组小鼠体重变化曲线图Fig 1 Results of different groups mice weight change over days

脾脏HE染色:对照组小鼠脾脏未见明显的病理改变，光镜下细胞形态规则，可见脾小体 (图3A);低剂量铁剂组小鼠脾脏出现轻度淤血，光镜下脾细胞排列杂乱，脾脏边缘区及红髄区出现褐色铁沉积，呈放射状分布，脾小体未受累 (图3B);中剂量铁剂组小鼠脾脏肉眼可见淤血水肿，光镜下脾脏边缘区及红髄区可见团块状褐色铁沉积 (图3C);高剂量铁剂组小鼠脾脏肉眼可见明显淤血，整个脾脏呈深褐色，光镜下脾脏满布铁颗粒，脾小体与红髄区界限不清 (图3D)。

骨髓活检HE染色及普鲁士蓝铁染色:对照组小鼠骨髓光镜下细胞排列整齐，形态规则;普鲁士蓝铁染色未见被染成蓝色的铁 (图4A1、4A2)。低剂量铁剂组骨髓光镜下未见明显铁颗粒;铁染色细胞内外均可见少量被染成蓝色的铁颗粒 (图4B1、4B2)。中剂量铁剂组骨髓可见细胞外有若干棕色铁颗粒或团块，呈梭形或不规则状;铁染色细胞内外均可见被染成蓝色的铁颗粒或团块 (图4C1、4C2)。高剂量铁剂组骨髓细胞外有大量铁存在，呈块状;铁染色可见视野满布蓝色铁团块 (图4D1、4D2)。

BMMNCs内LIP由于细胞内存在的LIP可以淬灭荧光探针Calcein，因此根据Calcein的MFI强弱测定各组细胞内LIP的相对水平。对照组MFI 41.44±5.53，低剂量铁剂组MFI 39.8±5.94，中剂量铁剂组MFI 38.42±6.76，高剂量铁剂组38.33±6.15，4组之间差异无统计学意义 (P＞0.05)。

骨髓造血细胞集落形成能力的变化 低、中、高剂量铁剂组小鼠骨髓细胞粒-单系集落形成单位数和对照组相比均显著下降 (P＜0.05)，中、高剂量铁剂组小鼠骨髓细胞红系集落形成单位数、混合系集落形成单位数和对照组相比显著下降 (P＜0.05)(图5)。

BMMNCs计数 对照组BMMNCs计数 (30.87±3.61)×106/Femur，低剂量铁剂组 (28.41±3.80)×106/Femur，中剂量铁剂组 (27.64±1.65)×106/Femur，高剂量铁剂组 (30.95±4.72)×106/Femur，4组骨髓有核细胞计数差异无统计学意义 (P＞0.05)。

外周血象的变化 和对照组相比，低、中、高剂量铁剂组外周血白细胞、血小板、红细胞、血红蛋白差异均无统计学意义，血小板低、中、高剂量铁剂组和对照组相比有轻度下降趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05)(表1)。

图2 肝脏HE染色结果 (×400)Fig 2 HE staining of livers(×400)

图3 脾脏HE染色结果 (×400)Fig 3 HE staining of spleens(×400)

图4 骨髓HE染色 (A1～D1)(×400)及普鲁士蓝铁染色 (A2～D2)(×1000)Fig 4 HE staining(A1-D1)(×400)and Prussian blue iron staining(A2-D2)(×1000)of bone marrow

图5 各组小鼠造血集落形成单位数Fig 5 Hematopoietic colony-forming units of different groups

讨 论

铁过载 (血色病)是铁代谢紊乱的疾病。铁在体内过度沉积，不但可导致重要脏器 (尤其是肝脏、脾脏、心脏和胰腺等)的结构损害和功能障碍，对骨髓造血及血液系统疾病的影响也不容乐观。近年的一些临床证据显示铁过载可抑制骨髓的造血功能［3-5］。由于临床患者取材受限，可重复性差，个体差异性也较大，铁过载机制研究进展缓慢，目前关于此方面的报道甚少。因此，建立小鼠铁过载模型对深入研究铁过载对骨髓造血功能的作用及机制有着重要的意义。

本研究通过给小鼠定期定量腹腔注射右旋糖酐铁，成功建立了小鼠铁过载模型。铁过载模型小鼠肝脏、脾脏中可见大量铁沉积，这与临床铁过载患者肝脏、脾脏铁大量沉积是一致的，与朱航等［6］的研究结果类似，但是朱航等［6］侧重于研究过量的铁在体内贮存对机体各脏器的损伤，对骨髓功能的影响未涉及。本研究创新性地对骨髓造血功能进行初步探索。骨髓活检的结果显示有大量铁存在于骨髓基质，BMMNCs内LIP结果差异无统计学意义，更进一步表明骨髓铁过载存在，但是铁主要存在于骨髓基质而非细胞内，与笔者前期体外实验的结果存在一定差异［7-8］。临床铁过载情况一般发生于骨髓损伤的患者如再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征等输血所致，这些患者的骨髓状况本身是不好的，在此基础上给予输血容易导致铁过载的发生。而本研究用的正常小鼠建立铁过载模型，可能机体由于强大的代偿机制未发现骨髓细胞铁沉积，这是本研究铁过载小鼠模型的不足之处。在病态骨髓的基础上建立铁过载模型，可能获得与临床继发性铁过载一致的结果。

表1 各组小鼠外周血象的改变 (n=10，±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10，±s)

表1 各组小鼠外周血象的改变 (n=10，±s)Table 1 Counts of peripheral blood cells(n=10，±s)

组别Group 白细胞White blood cells(×109/L)血小板Platelets(×109/L)红细胞Red blood cells(×109/L)血红蛋白Hemoglobin(g/L)对照组Control group 8.43±0.24 926.0±28.23 8.94±0.08 135.3±1.21低剂量铁剂组Low-dose iron group 8.73±0.83 780.7±39.60 8.86±0.21 146.8±6.01中剂量铁剂组Middle-dose iron group 8.62±1.21 676.2±21.43 8.78±0.71 132.4±1.23高剂量铁剂组High-dose iron group 8.27±0.89 587.3±19.67 8.65±0.97 131.9±4.62

在初步建立铁过载小鼠模型的基础上，本研究首先观察了铁过载对BMMNCs数目及功能的影响，发现集落形成单位数显著下降，计数各组差异无统计学意义，表明铁过载确实损伤了骨髓造血功能，进一步观察外周血象的改变，结果显示与对照组相比，各剂量铁剂组差异均无统计学意义，仅血小板有下降趋势，考虑可能由于正常骨髓造血功能储备比较强大，铁过载对正常骨髓功能的损伤不足以引起外周血象的显著改变。这与临床原发性铁过载患者的临床表现类似，而与继发性铁过载患者的临床表现存在一定差异。

综上，本研究通过给小鼠腹腔注射右旋糖酐铁成功建立铁过载模型，但是由于正常骨髓强大的代偿功能，虽然铁过载对骨髓造血集落有较明显的影响，而该影响不足以引起外周血象的改变。这现象与临床上原发性铁过载患者的情况基本符合，为以后深入研究铁过载发病的机制研究提供实验模型。

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