光温条件对三叶青愈伤生长及黄酮积累的影响

钱丽华，毛碧增

(1.浙江大学，浙江 杭州 310058;2.杭州市农业科学研究院，浙江 杭州 310024)

三叶青是中国特有珍稀中药植物，又名三叶崖爬藤、金线吊葫芦、蛇附子等，含有黄酮、多糖等生物活性成分，对多种癌症细胞株系具有促进细胞凋亡的作用，且对小儿高热、支气管炎、病毒性脑膜炎、血液病、心脑血管疾病、抗艾滋病毒和抗肿瘤治疗方面具有疗效，被称为安全无毒的“植物青霉素”。目前因过度采挖其野生资源已濒临灭绝。虽三叶青组培快繁和扦插技术均已得到解决，但其块根形成周期长，产量低，无法满足市场需求，因此利用组织培养生产次生代谢物是解决供需矛盾的可行途径之一。

目前对三叶青黄酮的研究集中在药理作用上，对愈伤组织的研究集中在诱导分化上，对光照和温度条件的研究还较少［1-5］。本研究旨在探索温度、光周期等培养条件对三叶青愈伤生长及次生代谢物形成积累的影响，为规模化生产三叶青黄酮提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

外植体试验材料采自建德市，取其叶片为外植体诱导愈伤组织，并以此为试验材料。

培养基采用MS 基本培养基，芦丁标准品(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH)，微波萃取仪 (美国CEM 公司生产)，UV-2550 紫外分光光度计。无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，亚硝酸钠(天津博迪化工股份有限公司)，硝酸铝(上海山浦化工有限公司)，NaOH (杭州化工试剂有限公司)，以上均为分析纯。

1.2 处理设计

1.2.1 温度试验

将三叶青叶片来源愈伤组织接种在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1中，每处理8 瓶，每瓶接5个。称取愈伤块原始质量W0，分别放置在23℃，25℃，28℃，30℃，34℃的光照培养箱中12 h·d-1培养30 d 后，再称取愈伤块质量W1，计算30 d 内愈伤鲜重增长率。愈伤鲜重增长率/%=(W1-W0)/W0×100。

1.2.2 光周期试验

将三叶青叶片来源愈伤组织接种在MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1培养基中，每个处理5 瓶，每瓶接种7个愈伤块，培养温度为(27 ±1)℃，分别进行24 h·d-1和12 h·d-1光照及暗培养30 d 后，测定各处理愈伤组织中总黄酮的含量。

1.3 总黄酮测定

洗去愈伤组织表面琼脂，吸干表面水分，置于电热干燥箱中于105℃下干燥0.5 h，使酶失活;然后60℃干燥后，用研钵磨细，继续干燥至恒重。测定方法参照文献［6］(经改良)。

对照品溶液。精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品2.394 5 mg 于25 mL 容量瓶中，加适量50%乙醇超声溶解，放冷，用50%乙醇定容至25 mL，即为对照品溶液(芦丁浓度为0.095 78 mg·mL-1)。

供试品60%乙醇溶液。称取0.3 g 供试品于萃取管中，加入7.5 mL，于微波萃取仪80℃下提取25 min，提取2 次，合并提取液。其他同文献［6］。

比色测定同文献［6］方法。

标准曲线。分别移取供试品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，按比色测定步骤执行。

2 结果和分析

2.1 不同培养温度对叶片愈伤继代培养的影响

在5个不同温度处理下，以34℃效果最差，叶片愈伤死亡率高达100%。说明三叶青叶片愈伤对34℃以上高温较敏感;另外4个温度处理中，28℃下的叶片愈伤组织鲜重增长率达到394.20%，显著优于其余各处理;其他3个处理间无显著差异。故28℃培养温度最适于三叶青叶片愈伤的生长;超过34℃，则愈伤组织受到高温伤害后无法修复而逐渐死亡(图1)。

图1 不同培养温度下愈伤鲜重增长变化

2.2 不同光周期对叶片愈伤中总黄酮含量的影响

3种光周期处理后，24 h·d-1光照有利于三叶青叶片来源愈伤组织中次生代谢物黄酮类化合物的积累。该处理下愈伤组织颜色深绿，结构致密，但表层有褐化现象，总黄酮含量达20.23 mg·g-1·DW-1(表1);12 h·d-1光照下愈伤组织浅绿，结构致密;黑暗条件下愈伤颜色为淡黄色，表层组织疏松，总黄酮含量明显低于24 h·d-1的光照处理。因此，24 h·d-1的光照处理是三叶青愈伤组织中黄酮类化合物积累的适宜培养条件。

表1 光周期对愈伤鲜重增长及总黄酮含量的影响

3 小结与讨论

植物组织培养中，光温条件是影响生长发育的关键因子，如何根据植物特性控制培养条件是组培中的重要问题［7］。植物生长发育具有温度三基点，即最低温度、最适温度和最高温度。在最适温度下，植物细胞生长、分裂活跃，植物生长最快。本试验中，28℃是三叶青愈伤生长的最适温度。

研究表明，光照在诱导分化时可激活某些酶的活性和光诱导的叶绿体代谢产物，从而影响细胞的生长和次生代谢物的积累［8］，但影响的效果因植物种类、试验材料而异。光照对许多植物中黄酮类化合物的合成有诱导作用［9］，叶绿体分化也与黄酮积累有关［10］，或者光照对苯丙氨酸解氨酶具有激活作用［11］。试验中，24 h·d-1连续光照有利于三叶青叶片来源愈伤组织中次生代谢物黄酮类物质的积累，而黑暗抑制黄酮化合物的合成。这与彭昕等［2］的研究结果一致。这为今后利用组培技术规模化生产三叶青黄酮提供了技术支撑。

另外，蔗糖、无机盐、pH、前体物质等对植物组培次生代谢物的形成和积累都存在一定的影响，后期可开展上述因素对三叶青愈伤组织中黄酮积累的影响研究，建立起三叶青愈伤组织生产黄酮的可行技术工艺。

［1］卢爱芳，祁明君，李宗亮，等.三叶青愈伤组织培养及其总黄酮含量的研究［J］.中药材，2010，33 (7):1042-1045.

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［4］彭昕，汪荣斌，何军邀，等.三叶青颗粒状愈伤组织悬浮培养系的建立及培养条件的优化［J］.中草药，2012，34(5):961-965.

［5］吴浩，彭昕，林言娜，等.三叶青愈伤组织诱导及分化培养基筛选［J］.现代农业科技，2011 (21):121-122，125.

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［7］沈海龙.植物组织培养［D］.北京:中国林业出版社，2005.

［8］卢文芸，张宇斌，罗迎春，等.不同培养条件对环草石斛愈伤组织中次生代谢产物的影响［J］.安徽农业科学，2009，37 (33):16365.

［9］Fuglevand G，Jackson J.UV-B，UV-A，and blue light signal transduction pathways interact synergistically to regulate chalcone synthase gene expression in Arabidopsis ［J］.Plant Cell，1996，8:2347.

［10］崔刚，唐蕾，王武.培养基和外源激素对银杏愈伤组织诱导、生长及叶绿素含量的影响［J］.食品与生物技术学报，2008，27 (2):117.

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