黄芩素抗人巨细胞病毒的体外实验研究*

乔 媛 方建国 肖 娟 刘 涛 刘 静 王 楠 陈素华

华中科技大学同济医学院附属同济医院 1妇产科，2药学部，武汉 430030 3泰安市中心医院，山东泰安 271000

·实验研究·

黄芩素抗人巨细胞病毒的体外实验研究*

乔 媛1方建国2肖 娟1刘 涛3刘 静1王 楠1陈素华1

华中科技大学同济医学院附属同济医院1妇产科，2药学部，武汉 4300303泰安市中心医院，山东泰安 271000

目的体外研究黄芩素抗人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)的效果和安全性。方法细胞病变法和噻唑蓝(MTT)法检测各浓度黄芩素对人胚肺成纤维细胞(HEL)存活率及HCMV抑制率的影响，并与更昔洛韦进行比较。数据输入SigmaPlot软件，经Hill方程曲线拟合计算药物的半数毒性浓度(TC50)和半数有效浓度(EC50)。结果更昔洛韦和黄芩素的TC50分别为353.1g/ml和151.4g/ml，EC50分别为62.98g/ml和14.47g/ml，治疗指数分别为6和10。结论黄芩素具有体外抗HCMV作用，值得进一步研究。

黄芩素； 人巨细胞病毒

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV) 属于疱疹病毒β亚科，是引起先天性感染的最常见病毒。 据报道[1-2]，孕妇HCMV原发性感染率1％～7％，其宫内传播率30％～40％，宫内感染可导致流产、死胎、早产、胎儿畸形、智力发育落后等远期后遗症。目前，疫苗研究尚不成熟，更昔洛韦具有良好的抗HCMV作用，但由于其胚胎毒性、致突变性等问题，属于妊娠期C类用药[3]。因此，急需研究可在妊娠期使用的抗HCMV药物。中国传统中药黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效，其主要有效成分黄芩素具有抗菌、抗病毒、抗感染、抗氧化、抗肿瘤及清除自由基等多种药理作用[4]。为此，本文首次通过体外实验，研究黄芩素抗 HCMV的效果及安全性，并与更昔洛韦进行比较，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与细胞 HCMV AD169毒株由湖北省病毒研究所提供，人胚肺成纤维细胞株(human embryo lung fibroblast，HEL)由本院妇产科围产医学实验室保存。 细胞和病毒按常规方法在围产医学实验室培养传代，并测定病毒半数组织培养感染量(50％ tissue culture infective dose，TCID50)。

1.1.2 主要试剂 DMEM高糖型培养液(美国Hyclone公司)，使用前加入10％ 小牛血清为细胞培养液，加入3％ 小牛血清为细胞维持液；细胞消化液为0.25％ 胰蛋白酶。噻唑蓝(MTT，美国Sigma公司)用 0.01 mol/L PBS液 (pH=7.4 ) 溶解至浓度为5 mg/ml，0.22m微孔滤器过滤除菌，分装，4 ℃ 避光保存备用，2周内有效。

1.1.3 药物 ①研究药黄芩素由华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部提供，用二甲基亚砜(DMSO)溶解，-20 ℃冻存备用；使用前用细胞维持液稀释至10 mg/ml，其中DMSO 终浓度不超过0.1％；②对照药更昔洛韦 (ganciclovir，GCV) 注射用灭菌粉剂(商品名丽科伟，湖北科益药业股份有限公司，规格0.25 g/amp，批准文号：国药准字H20030419，生产批号：100532)，用细胞维持液配制成10 mg/ml的母液。以上各药品均用0.22m孔径微孔滤器过滤除菌，分装，4 ℃保存，临用前用细胞维持液稀释至所需浓度。

1.2 方法

1.2.1 病毒毒力测定 取生长良好的HEL经0.25％胰蛋白酶消化后，用细胞培养液调细胞数为2×105个/ml，加至96孔细胞培养板，每孔0.1 ml，置37 ℃，5％二氧化碳培养箱培养24～48 h，待细胞长成单层后，吸弃各孔培养液，将HCMV按2倍梯度稀释8个浓度，每个浓度接种4孔，每孔100l；另设正常细胞对照4孔，培养7 d，每日观察记录细胞病变(cytopathic effect，CPE)，CPE判定标准如下：(-)示细胞无病变，(+)示25％细胞出现病变，(++)示25％～50％细胞出现病变，(+++)示50％～75％细胞出现病变，(++++)示75％～100％细胞出现病变。应用Reed-Muench法计算半数组织细胞感染量(50％ tissue culture infective dose，TCID50)。Reed-Muench法计算公式：TCID50=10a。其中，a= lgTCID50=高于50％细胞病变率病毒稀释度的对数+距离比例×稀释度对数之间的差；距离比例=(高于50％细胞病变率的百分数-50)/(高于50％细胞病变率的百分数-低于50％细胞病变率的百分数)。

1.2.2 黄芩素细胞毒性测定 将HEL接种至96孔板，待细胞长成单层后，吸弃各孔培养液，将各药物自母液开始按10倍梯度用细胞维持液稀释8个浓度，使其终浓度为10.00 mg/ml、5.00 mg/ml、2.50 mg/ml、1.00 mg/ml、0.50 mg/ml、0.25 mg/ml、125.00g/ml和62.50g/ml，每个浓度设5孔，每孔100l，另设4孔正常细胞对照。置37 ℃，5％CO2培养箱培养72 h，采用细胞病变(CPE)法和噻唑蓝 (MTT)法两种方法研究药物的细胞毒性：①细胞病变(cytopathic effect，CPE)法：按常规于倒置显微镜下，每日观察并记录细胞生长情况及形态变化，确定各药物对HEL的最大无毒浓度(0％ toxic dose，TD0)。判定标准如下：加药后出现细胞皱缩、细胞间隙变大、胞质粗糙、不透明、细胞内有较多颗粒等形态改变记录为(+)，示细胞出现药物毒性反应；细胞形态正常记录为(-)，示细胞无药物毒性反应；未出现细胞形态改变的最大药物浓度即为黄芩素对HEL的TD0。②MTT法：加入药物后，置37 ℃，5％CO2培养箱培养3 d，取出以PBS液冲洗细胞3遍，每孔加入MTT溶液20l，继续孵育4 h，终止培养，吸弃各孔培养液，每孔加入DMSO 100l，溶解紫蓝色结晶，振荡10 min，使结晶充分溶解。选择492 nm波长，用96孔酶标测定仪读取各孔吸光度OD值，计算细胞存活率=(药物处理组OD值/正常组对照孔OD值)×100％，经Hill方程曲线拟合计算药物的半数毒性浓度(50％ toxic concentrations，TC50)。

1.2.3 黄芩素抗HCMV效果测定 细胞接种96孔板，待细胞长成单层后，用100 TCID50的病毒攻击量接种细胞，37 ℃，5％ CO2培养箱孵育2 h，弃上清后，将各药物自TD0开始按2倍梯度稀释7个浓度，每个浓度设5孔，另设正常细胞对照和病毒对照组各5孔，培养7～10 d，采用MTT法研究药物对HCMV致细胞病变的抑制作用：MTT法染色及测定OD值同上，根据OD值计算病毒抑制率。病毒抑制率=[(药物处理组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/正常对照组OD值]×100％，经Hill方程曲线拟合计算药物的半数有效浓度(50％ effective concentrations，EC50)。最后计算治疗指数(TC50/EC50)。

以上实验至少重复3次，取3次试验结果的平均值作为试验结果。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件处理所有的数据，浓度反应曲线用Hill公式求TC50及EC50。

2 结果

2.1 HCMV 毒力

与正常HEL相比，HCMV 感染细胞变圆，肿胀，细胞间界限不清，培养液中可见多个脱落细胞。病毒感染性滴度测定结果，根据Reed-Muench公式计算，HCMV AD169毒株的TCID50为10-4.87。见图1、表1。

A：正常HEL；B：HCMV感染HEL

表1 病毒感染性滴度测定结果

2.2 黄芩素细胞毒性

2.3 黄芩素对HCMV致细胞病变的抑制效果

MTT法检测不同浓度的更昔洛韦、黄芩素对病毒抑制率的影响，经Hill方程计算，两者的EC50分别为62.98g/ml和14.47g/ml，h系数分别为0.791和1.017(见图3)，即两种药物均具有病毒抑制作用，且具有剂量依赖性，药物浓度越高，病毒抑制率越高。其中，黄芩素的病毒抑制作用相对较高。

图2 黄芩素和更昔洛韦对HEL存活率的剂量-反应曲线(Hill方程拟合)

图3 黄芩素和更昔洛韦对HCMV抑制率的剂量-反应曲线(Hill方程拟合)

2.4 治疗指数(TC50/EC50)

更昔洛韦治疗指数为353.1/62.98≈6，黄芩素治疗指数为151.4/14.47≈10，黄芩素治疗指数高于更昔洛韦。

上述结果提示，更昔洛韦和黄芩素在体外均具有抗HCMV作用，黄芩素的治疗指数高于更昔洛韦。

3 讨论

HCMV具有条件致病性，其感染率与地理位置、社会经济状况、种族及文化程度等相关[5-7]。HCMV是发展中国家最常见的宫内感染病原体，可经血流通过胎盘垂直传播给胎儿[8]，约10％宫内感染儿出生后出现小头畸形、低出生体重、肝脾肿大、血小板减少、高胆红素血症、脉络膜视网膜炎等，约10％～15％出生时无症状的感染儿在出生后数年出现进行性感音神经性耳聋、认知能力发育落后等异常[9]。

目前，尚无任何获得批准的疫苗用于预防HCMV宫内感染，亦无任何获得批准的药物用于治疗妊娠期感染[10]。临床广泛使用更昔洛韦治疗HCMV感染，如免疫缺陷病毒感染或器官移植术受体合并HCMV感染[11]，但更昔洛韦属于妊娠期C类药物[3]，具有一定的胚胎毒性，妊娠期使用受到限制。因此，临床急需既具有抗HCMV作用、又可在妊娠期使用的药物。现代医学研究[12-14]发现，我国传统中药的许多有效成分，如生物碱(如黄连)、黄酮(如黄芩)、有机酸(如金银花)、挥发油(如连翘)等，具有较强的抗病毒活性和增强机体免疫功能等作用，孕期常用药物黄芩具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效，其主要有效成分黄芩素可体外阻断表皮生长因子酪氨酸激酶活性、降低HCMV周期相关调节蛋白表达、下调HCMV DNA水平。

为了系统研究黄芩素抗HCMV作用及妊娠期使用的安全性，本文以更昔洛韦为对照药，应用细胞病变法和MTT法，体外分析黄芩素的细胞毒性及抗HCMV的效果。结果显示，与更昔洛韦类似，黄芩素在体外具有抗HCMV 作用，并具有剂量依赖效应。综合分析两种药物的细胞毒性和抗HCMV效应，黄芩素的治疗指数高于更昔洛韦的治疗指数，具有一定的临床应用前景，值得进一步深入研究。

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AntiviralEffectsofBaicaleinonHumanCytomegalovirusinVitro

QIAO Yuan1，FANG Jianguo2，XIAO Juan1，et al

1DepartmentofObestetricsandGynecology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China2DepartmentofPharmaecutical,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China

ObjectiveTo study the anti-cytomegalovirus effect and security of baicalein.MethodsHEL cell viability and HCMV inhibitory rate of baicalein in different dosage groups were detected with the cytopathic assay and MTT method，and ganciclovir was used as the control drug for comparison.All data input SigmaPlot statistical software for analyzing 50％ toxic concentrations(TC50)and 50％ effective concentrations (EC50).ResultsThe TC50of ganciclovir and baicalein were 353.1g/ml and 151.4g/ml；the EC50were 62.98g/ml and 14.47g/ml；TI were 6 and 10，respectively.ConclusionBaicalein has the potential advantages for clinical use and worth further study.

baicalein；human cytomegalovirus

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.004

*国家自然科学基金资助项目(No：39970769，30371488，30672243)；

湖北省自然科学基金资助项目(No：2009CDD216)；

国家自然科学青年基金资助项目(No：81200354)

2013-01-11)