肺积方对Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表达的实验研究

陈学彰 田华琴 黄志庆 梁贵文 黄小青 王 斌 杨耀林

佛山市中医院，广东佛山 528000

肺积方对Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表达的实验研究

陈学彰 田华琴 黄志庆 梁贵文 黄小青 王 斌 杨耀林

佛山市中医院，广东佛山 528000

目的观察肺积方对Lewis肺癌小鼠肿瘤表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响。方法将48只近交系C57小鼠常规接种Lewis肺癌细胞，随机分为模型组、顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组，每组12只。治疗后处死，取肿瘤组织称重，计算抑瘤率，并将肿瘤组织固定于10％甲醛溶液，常规石蜡包埋切片，免疫组化检测、图像定量分析EGFR及TNF-α的表达。结果顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组，其对肿瘤均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为30.95％、15.54％、39.79％。与顺铂组比较，EGFR的积分光度由高到低、平均灰度由低到高分别为肺积方组、顺铂组、顺铂+肺积方组(Plt;0.05)。与顺铂组相比，TNF-α的积分光度由低到高、平均灰度由高到低分别为肺积方组、顺铂组、顺铂+肺积方组(Plt;0.05)。结论肺积方对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织的生长具有一定的抑制作用，但低于顺铂组，顺铂与肺积方联合使用效果最佳，其机制可能与降低EGFR的表达及调节肿瘤坏死因子TNF-α的表达有关。

肺积方； Lewis； 肺癌； 表皮生长因子受体； 肿瘤坏死因子-α

原发性支气管肺癌简称肺癌，是全球常见的恶性肿瘤之一。近数十年肺癌的发病率和病死率都有明显增高的趋势，目前已成为我国恶性肿瘤中排名第一位的杀手。中医认为肺癌是正气虚损与邪毒长期共同作用的结果，以气虚、阴虚尤为明显[1]。有临床研究[2-3]表明：肺癌病例的证候分布，以正虚为主者超过97％，且以阴虚和气阴两虚两种类型为多，占总数的80％以上。肺积方是本院肿瘤内科使用益气养阴法治疗肺癌的经验方，临床疗效显著。本实验通过观察肺积方对Lewis肺癌小鼠肿瘤表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达的影响，探讨肺积方抗肿瘤的分子作用机制，为临床提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及瘤株

近交系C57小鼠51只，其中3只用作传代，体重为(18.0±2.0)g，购自广州医药大学实验动物中心(合格证号：0043452)。Lewis肺癌小鼠细胞购自福州迈新生物技术有限公司。

1.2 药物

肺积方：浙贝、天冬、沙参、石上柏、八月扎、薏苡仁、鱼腥草。用文火煎汁浓缩，采用人动物剂量换算公式换算为小鼠用量，0.4 ml合生药60 g的剂量，置于4 ℃冰箱备用。顺铂：10 mg/支。

1.3 试剂及仪器

EGFR免疫组化SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(上海晶科生物有限公司，批号：20110130)，TNF-α的免疫组化DAB显色试剂盒(上海晶科生物有限公司，批号：20110130)，鼠抗人EGFR抗体(福州迈新生物技术有限公司，批号：20110217)。生物显微镜、恒温水浴箱等。

1.4 方法

1.4.1 造模及分组 液氮冻存的Lewis肺癌小鼠细胞复苏后，先接种在3只C57小鼠右腋窝下传代。10 d后，脱颈处死荷瘤小鼠，分离瘤体，取生长良好的肿瘤组织，加生理盐水，制成单细胞悬液，并调整瘤细胞密度为每毫升生理盐水中含1×10个瘤细胞。选C57小鼠48只，于每只小鼠右腋窝皮下注射肿瘤悬液0.2 ml。随机分为4组，每组12只小鼠，分别为模型组、顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组。

1.4.2 给药 模型组：接种24 h后开始予生理盐水0.4 ml/只灌胃，1次/d，共14 d，从接种第6天开始腹腔注射生理盐水0.2 ml/只，1次/d，连续5 d。顺铂组：从接种后第6天开始腹腔注射顺铂，按每公斤体重1 mg的剂量(相当于1/10 LD50)给药，1次/d，余同模型组。肺积方组：接种24 h后开始予肺积方0.4 ml/只灌胃，1次/d，共14 d；从接种第6天开始腹腔注射生理盐水0.2 ml/只，1次/d，连续5 d。顺铂+肺积方组：同顺铂组+肺积方组处理。

1.4.3 标本采集 灌胃14 d后，动物禁食不禁水24 h，将小鼠脱颈处死，即刻解剖小鼠进行局部肿瘤取材，把肿瘤组织称重，并固定于10％的甲醛溶液，常规石蜡包埋切片。

1.5 检测指标

1.5.1 抑瘤率 常规统计各组小鼠的抑瘤率(％)。

1.5.2 瘤块EGFR表达的测定 采用免疫酶标技术(SABC法)作免疫组化染色。免疫组化法将石蜡切片常规脱蜡至水，封闭内源性过氧化酶活性。4 ℃条件下将标本与1∶100稀释的CB一抗孵育过夜的PBS洗涤3次后，再与生物素标记的二抗作用，PBS洗涤3次后加入结合有辣根过氧化酶的生物素-卵白素复合物，最后加入底物DAB染色，凡细胞质出现棕黄色颗粒者为阳性染色细胞。对实验结果采用计算机图像分析：于400倍高倍视野下，随机选取各组10个视域，测取棕黄色反应物场，观察积分光度、平均灰度。其中积分光度值越高免疫组化的阳性表达强度越高；而平均灰度值越高其阳性表达强度越低。

1.5.3 TNF-α表达的测定 组织石蜡切片采用免疫组化法作测定。依次进行石蜡切片，脱水，5％～10％山羊血清封闭，4 ℃条件下将标本与CB一抗孵育过夜的PBS洗涤3次后，再与生物素标记的二抗作用，PBS洗涤3次后加入结合有辣根过氧化酶的生物素-卵白素复合物，最后加入底物DAB染色，然后对实验结果采用计算机图像分析。

1.6 统计学处理

采集免疫组织化学染色图像，用同济医科大学研制的MPIAS-500多媒体病理图像分析系统进行图像分析。采用SPSS 13.0统计软件，计量资料用q检验，以Plt;0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织生长的影响

与模型组比较，顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组对小鼠肿瘤组织生长均有抑制作用(Plt;0.05)。与顺铂组比较，肺积方组对肿瘤组织的抑制作用较弱(Plt;0.05)，顺铂+肺积方组与顺铂组比较无明显差异。见表1。

2.2 对Lewis肺癌小鼠EGFR表达的影响

顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组与模型组比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明三组对肿瘤组织中EGFR的表达均有抑制作用。与顺铂组比较，肺积方组对肿瘤组织中EGFR的表达的抑制作用较弱(Plt;0.05)，而顺铂+肺积方组较强(Plt;0.05)。见表2。

表1 对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织生长的影响(n=12)

与模型组比较▲Plt;0.05；与顺铂组比较△Plt;0.05

表2 对Lewis肺癌小鼠EGFR表达的影响(n=12)

与模型组比较▲Plt;0.05；与顺铂组比较△Plt;0.05

2.3 对Lewis肺癌小鼠TNF-α表达的影响

顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组与模型组比较差异有统计学意义(Plt;0.05)，说明三组对肿瘤组织中TNF-α的表达均有抑制作用。与顺铂组比较，肺积方组对肿瘤组织中TNF-α的表达抑制作用较弱(Plt;0.05)，而顺铂+肺积方组较强(Plt;0.05)。见表3。

表3 对Lewis肺癌小鼠TNF-α表达的影响(n=12)

与模型组比较▲Plt;0.05；与顺铂组比较△Plt;0.05

3 讨论

中医学认为肺为“娇脏”，位居华盖，喜润恶燥，易受内外邪气的侵袭，一旦邪毒蕴肺，极易耗伤肺气，灼伤肺阴。气阴亏虚常常贯穿肺癌发病始终，而益气养阴之法是中医药治疗肺癌之本，也是目前的主要治疗大法[4]。本院肺积方是治疗肺癌的经验方，以益气养阴为主，方中北沙参性味甘、微苦，微寒。归肺、胃经。轻扬上浮，具有补肺阴，清肺火之功。南沙参性味甘、微寒。归肺、胃经。功效养阴清肺、补气化痰。南北沙参相配，润肺止咳，滋阴祛痰。天冬性寒，味甘、苦。上能入肺，下能补肾，滋阴润燥之力更强。三药联合，补气而不补火，滋阴而不滋腻，共奏益气养阴之功。浙贝味大苦，性寒，功能清热化痰，散结解毒。八月扎性微寒，味苦，能泻火行水、通血脉。石上柏味甘，性平，能清热解毒、活血化瘀。两药配伍，共奏活血祛瘀、清化癌瘤之效。生苡仁性味甘淡微寒，既去生痰之源又无伤阴之弊。鱼腥草辛,微寒，归肺经，能清热解毒、消痈排脓。全方培土生金、金水相生共冶一炉，共奏益气养阴、活血通络、清热散结之功。

EGFR是一种细胞膜受体，能与EGF及TGF-α等有效结合，引起细胞增殖。在病理状态下，EGFR可能存在自身激活从而导致细胞的异常增殖，并在细胞的恶性转化中发挥重要作用。EGFR在肺癌中高表达，与肿瘤细胞的增殖、肿瘤血管生成、黏附、侵袭、转移和肿瘤细胞的凋亡等密切相关[5]。Piyathilake等[6]用免疫组化法检测了60例肺鳞癌患者的肿瘤组织和正常肺组织标本中EGFR和erbB22的表达，结果肺鳞癌组织中EGFR 和erbB22的表达明显高于正常肺组织，而且EGFR在正常肺组织、癌前病变和肺癌组织中的表达是逐级升高的。

TNF-α是一种具有多种生物学活性的细胞因子，主要来源于单核细胞和巨噬细胞，它是参与机体免疫反应与炎症反应的重要调节因子，具有抗肿瘤、抗感染等作用，可作为肿瘤复发、转移的标记物及鉴定肿瘤预后的一项指标，参与多种生理与病理过程[7]。TNF-α主要通过以下三方面机制发挥抗肿瘤作用[8]：①对敏感的肿瘤细胞有直接的细胞毒作用或抑制肿瘤细胞生长的作用；②多种细胞因子的产生、释放、并激活宿主的抗肿瘤机制，通过免疫调节发挥抗肿瘤作用;③对肿瘤血管结构的影响发挥抗肿瘤作用。其最大特点是能选择性杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤细胞增殖，而不影响正常细胞的生长、分泌和代谢功能。

对于TNF-α的表达，本研究证明：顺铂组、肺积方组、顺铂+肺积方组与模型组比较，积分光度与平均光度均升高，平均灰度降低，差异有统计学意义(Plt;0.05)。与顺铂组相比，积分光度由低到高、平均灰度由高到低分别为肺积方组、顺铂组、顺铂+肺积方组，差异有统计学意义(Plt;0.05)。说明肺积方能促进TNF-α分泌，抑制Lewis肺癌肿瘤细胞增殖与转移，但效果不及顺铂组，肺积方联合顺铂效果更佳。

而关于EGFR的表达，实验证明：肺积方、顺铂、顺铂+肺积方对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织的生长均有抑制作用且均能降低EGFR的表达，但肺积方组的抑制作用及降低EGFR表达的作用不如顺铂组及顺铂+肺积方组。考虑其原因有以下两点：①给药途径不同。肺积方为口服，顺铂为腹腔注射，前者无论是吸收速度抑或利用率都低于后者。②作用机制不同。肺积方为中药汤剂，其作用为全身多靶点的，其具体作用机制及最佳剂量、疗程不清，本实验只能依照经验制订药物使用剂量及疗程；顺铂为主要作用在DNA的嘌呤和嘧啶碱基的重金属络合物，经过众多实验研究及临床应用，其最佳剂量及疗程相对明确，且被本实验严格执行。因此本实验观察到肺积方抑瘤及降低EGFR表达的作用相较于顺铂及顺铂+肺积方不理想，可能与其尚未达到需要的血药浓度、药物持续作用时间不足有关。适当延长疗程或制成注射液静脉给药，肺积方的作用结果可能会更理想，尚有待于进一步实验研究。

另外，在对EGFR表达的检测中，本实验应用计算机进行图像分析，大大提高了信息的精度，使实验具有更高的精密度和客观性[9]。各实验组对Lewis肺癌小鼠肿瘤组织中EGFR表达图像分析结果与其对瘤体重量影响的结果具有高度一致性，可见抑瘤的作用机制与降低EGFR的表达密切相关，但其具体机制尚有待于进一步研究。

[1]朱伟伟,沈敏鹤.吴良村辨治肺癌经验[J].浙江中医杂志,2008,43(10):571.

[2]孙建立,刘嘉湘,徐蔚杰.原发性支气管肺癌中医证的特征研究[J].中国中医基础医学杂志,2007,13(7):536-537.

[3]刘嘉湘.中医药治疗肺癌研究思路和临床经验[J].世界中医药,2007,2(2):67-68.

[4]任莉莉,韩知忖.益气养阴法在肺癌治疗中的研究进展[J].浙江中医杂志,2011,46(4):304-305.

[5]李榕.EGFR检测在肺癌中的临床意义[J].临床肿瘤学杂志,2004,9(4):420-421.

[6]PIYATHILAKE CJ，FROST AR，MANNE U,et al.Differential expression of growth factors in squamous cell carcinoma and precancerous lesions of the lung[J].Clin Cancer Res,2002,8(3):734-744.

[7]王晓戎.益气养阴法抗肿瘤作用机制研究进展[J].中医药临床杂志,2004,16(4):390-393.

[8]吕志敢,郭政.肿瘤坏死因子的研究进展[J].山西医科大学学报,2006,37(3):311-312.

[9]张绘宇,张雅洁.非小细胞肺癌生物学特性免疫组化图像定量分析[J].中国体视学与图像分析,2006,11(2):77-79.

ExperimentalStudyofFeijiRecipeonAntitumorRate，ExpressionofEGFRandTNF-αinMicewithLewisLungCancer

CHEN Xuezhang，TIAN Huaqin，HUANG Zhiqing，et al

FoshanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Guangdong，Foshan528000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Feiji recipe on tumor weight，epidermal growth factor receptor(EGFR)and tumor necrosis factor-α (TNF-α) expressions in mice bearing Lewis lung cancer.Methods48 inbred c57 mice were inoculated with Lewis lung cancer cells，then divided into model group，cisplatin group，Feiji recipe group，and cisplatin+ Feiji recipe group.Each group contains 12 mice.After 14 days’ treatment the mice were sentenced to death.Weigh the tumor tissues，calculate antitumor rates，then fix the tissue with 10％ formaldehyde solution，routinely make paraffin-embedded sections，and use immunohistochemistry to detect the expression of EGFR and TNF-α.ResultsCisplatin，Feiji recipe and cisplatin+ Feiji recipe all have inhibitory effects on Lewis lung cancer (Plt;0.05)，and all can decrease the expression of EGFR(Plt;0.05) while increase the expression of TNF-α.Compared with cisplatin group，the effect of cisplatin+ Feiji recipe group and Feiji recipe group is not good.ConclusionFeiji recipe can inhibit the growth of Lewis lung cancer tumor，but the effect is not better than cisplatin group.The inhibiting effect is more significant by cisplatin combining with Feiji recipe.Its mechanism has correlation with decreasing the expression of EGFR and increasing the expression of TNF-.

Feiji recipe；Lewis；lung cancer；EGFR;TNF-α

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.005

2013-01-06)