噬菌体治疗细菌感染的研究进展

裴景亮，付玉荣 综述

(1.潍坊医学院医学检验学系、附属医院检验科、山东省临床检验诊断学高校重点实验室，山东 潍坊 261031;2.潍坊医学院基础医学院病原生物学教研室，山东 潍坊 261053)

耐药菌特别是多重耐药菌的出现对人类健康构成了极大威胁，这类细菌感染的疾病面临无药可用的境地。寻找新的有效的抗菌制剂已经成为刻不容缓的问题。噬菌体制剂作为新型的治疗方法，受到越来越广泛的关注。

噬菌体(bacteriophage，phage)是一类特异性感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒，广泛存在于水、土壤、植物、动物和人体中，其遗传物质和结构都非常简单，必须寄生于细菌、真菌等宿主体内，借助宿主菌的酶系统及其他条件才能进行复制。

1 噬菌体裂解细菌的机制与代谢动力学

根据噬菌体与宿主菌的关系，一般认为烈性噬菌体更适合作为细菌感染治疗的工具。噬菌体在宿主菌体内具有自我复制功能，因此很难构建一个数学模型来揭示噬菌体的代谢动力学，以及采取何种给药途径进行治疗也没有严格的标准。在体内噬菌体发挥杀菌作用还与机体的免疫状况密切相关。Birendra 等［1］在中性粒细胞减少的绿脓杆菌感染的小鼠模型中发现，PA1Φ 不能保护中性粒细胞减少的小鼠的绿脓杆菌感染，研究证实:噬菌体与中性粒细胞联合作用会起到更好的作用。噬菌体控制细菌感染有2 种方式:被动治疗与主动治疗。被动治疗则指最初的噬菌体剂量足以在数量上大大超过细菌，细菌一次吸附了大量的噬菌体颗粒，细菌被裂解。主动治疗指噬菌体侵染细菌后在细菌体内增殖再次攻击细菌发挥裂解作用。Birendra 等［1］的实验证明，噬菌体在体内72 h即可被机体的免疫系统清除，噬菌体的这种动力学特性决定了其给药途径与传统的抗生素截然不同。

噬菌体对宿主菌的溶解是由噬菌体自身蛋白介导的溶解系统完成的。缺乏溶壁酶的小基因组噬菌体利用多肽在不同阶段抑制宿主菌的胞壁质合成酶，从而在不同阶段溶解宿主菌。目前研究比较清楚的大肠杆菌λ 噬菌体，其裂解基因包括S、R 和RZ3个基因［2］。R 基因和RZ 基因的产物分别降解细胞壁的肽聚糖和切割肽聚糖寡糖间的交联，而S 基因的产物作用于细胞膜上形成孔洞，使R 基因和RZ 基因产生的酶到达细胞壁，从而降解细胞壁的肽聚糖。

2 全菌噬菌体制剂治疗细菌感染的应用

2.1 全菌治疗的应用 近几年，研究人员对噬菌体的筛选、分离纯化、治疗前的处理、药物动力学等进行了大量的研究［3］，实验证明，噬菌体治疗细菌感染具有很高的有效性和安全性，尤其是耐药菌的感染。耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)的治疗是临床上面临的棘手的问题，Capparelli 等［4］人利用噬菌体来控制MRSA 的感染，取得了良好的效果，其研究结果显示MRSA 的噬菌体在体内和体外都可以杀灭巨噬细胞内部的MRSA。噬菌体的指数增殖能力是噬菌体治疗的突出优势，只需少量的噬菌体就可以完成裂解细菌的工作。噬菌体具有高度特异性，不会影响到其他的菌群，不会破坏体内微生态的平衡、导致其他耐受性致病菌的生长，也很少引起胃肠道反应、过敏反应等［5］。Birendra 等［1］观察了一种新型绿脓杆菌噬菌体PA1Φ 在小鼠绿脓杆菌感染模型中的作用，发现噬菌体能有效地治疗致死剂量的绿脓杆菌引起的感染，小鼠的存活率可达80%～100%。噬菌体治疗小鼠没有产生败血症任何迹象，而未经处理的小鼠表现出垂死的状态，最后死于败血症。随后的研究也证实了PA1Φ 噬菌体在体内有很强大的杀菌功效［6-7］。感染肺炎克雷伯菌的烧伤小鼠模型注射噬菌体，可使小鼠成活率达73.33%［8］，显著高于常规药物治疗组。

2.2 全菌的给药途径 噬菌体的给药途径是目前的一个研究热点，与噬菌体治疗的成效密切相关，目前最常用的是口服和注射两种途径。口服噬菌体制剂在治疗胃肠道感染时被认为是最有效的给药方式。口服后噬菌体制剂要在胃液的高酸性环境中保持活性，必须采取一定的措施，有报道采用聚合物的胶囊可以保护噬菌体，从而提高疗效［9］。Oliveira 等［10］的研究证实一些口服的噬菌体有被吸收进入全身循环的能力，研究结果证明某些噬菌体可能不仅驻留在肠腔而且还通过肠壁，这个过程类似于细菌的移位定值，这个过程可能与噬菌体的浓度、噬菌体与肠道免疫细胞的相互作用、噬菌体的特定序列有关。动物实验证明，注射是一个最常用也最成功的噬菌体治疗给药途径，因为噬菌体能迅速分布到全身，迅速到达感染部位。然而最近的研究表明，不同的注射方式，如肌肉注射、皮下注射、腹腔内注射疗效却不一致，但都表明噬菌体的浓度越大，其抗菌效果越好［11-13］。雾化吸入噬菌体用于肺部细菌感染是现在的一个重要突破，有研究证实噬菌体制成干粉后在4℃～22℃的情况下可保持稳定性达三个月，可以作为治疗肺部细菌感染的一个重要方式［14-15］。另外噬菌体制剂局部外用以及医疗设备的杀菌都有成功的例子［16-18］。

2.3 全菌治疗遇到的问题 活噬菌体制剂宿主特异性太强，宿主谱太窄是目前的主要问题。自然分离的噬菌体都具有高度专一的宿主选择性，往往只能感染单一的细菌分离株，为了解决这一问题，有研究采用鸡尾酒疗法，不同菌株的噬菌体混在一起，拓宽噬菌体的裂解谱，结果表明混合噬菌体在很多时候优于单一的噬菌体制剂［19-20］。利用分子生物学技术，拓展噬菌体的宿主谱，为噬菌体制剂的应用提供了一个新的思路。Mahichi 等［21］利用同源重组技术，用宽宿主谱噬菌体IP008 的g37 和g38 替代T2 噬菌体的相应基因，得到的重组噬菌体获得了与IP008 相同的宿主谱，并保持了其裂解活性。这些研究表明，通过遗传改造噬菌体的宿主识别基因可以人为改变噬菌体的宿主谱。

机体免疫系统对噬菌体的清除也是噬菌体治疗中必须解决的一个重要问题。此外，机体免疫系统产生针对噬菌体的中和抗体，引起噬菌体失活，为了避免出现这一情况，需要找到降低噬菌体免疫原性的方法。

噬菌体会将某些毒力基因水平转移至细菌中。对于那些由噬菌体传播的毒性基因和耐药性基因，解决的办法是选择合适的噬菌体，避免使用具有转导作用的噬菌体，以及构建遗传学突变的噬菌体。噬菌体治疗的药代动力学可能会比常规药物更为复杂。其机制还需进一步研究。

3 噬菌体裂解酶制剂的应用

为了克服活性噬菌体制剂的局限性，人们设想提纯活性噬菌体的特异性裂解酶作为抗菌制剂治疗细菌感染。这种特异性裂解酶是一类细胞壁裂解酶类，它与细菌细胞壁的糖基特异性结合，发挥作用;而这种细胞壁糖基具有种属特异性。纯化的噬菌体裂解酶可以用于细菌感染的治疗和预防是Nelson 等2001年证实的。这种胞壁质裂解酶在噬菌体感染革兰阳性菌和革兰阴性细菌时发挥重要作用，研究表明，纯化的噬菌体裂解酶Cpl-1 在肺炎链球菌引起的心内膜炎和细菌性脑膜炎的试验中，显示出了良好的抗菌活性［22］。全菌噬菌体和噬菌体裂解酶制剂治疗细菌感染的优缺点见表1。

表1 全菌噬菌体和噬菌体裂解酶制剂治疗细菌感染的优缺点Table 1 The advantages and disadvantages of bacteriophage and lytic enzymes

内溶素作为一种裂解酶制剂受到越来越多的的关注，Bokyung［23］首次报道LysB4 噬菌体内溶素具有很强的抗菌作用，而且噬菌体内溶素具有较宽的抗菌谱，在革兰阳性及革兰阴性菌种都表现出了抗菌作用;研究还发现LysB4噬菌体内溶素最适pH8.0～10.0，活性需要二价金属，特别是Zn 离子的参与。

葡萄球菌属细菌引起的感染在人和动物都很常见，而且能通过多种途径获得耐药性，现在治疗此类感染变得非常困难。噬菌体编码的内溶素不仅能高效的杀灭耐药菌而，且在体内无残留。Hirofumi 等［24］从污水中分离了P-27/HP噬菌体，并纯化了其内溶素。在SDS-PAGE 电泳中P-27/HP 内溶素分为33.5 kDa、48.6 kDa与62.2 kDa 三个片段。体外实验证明，在37℃～40℃，pH 为7.0，内溶素具有最大杀菌活性;动物实验也证实了P-27/HP 内溶素强大的杀菌作用。

有些裂解酶在裂解细菌细胞壁时，因为缺少信号肽而需要Holin 蛋白的协助。Holin 蛋白是一种疏水性跨膜蛋白，在噬菌体复制晚期，于宿主菌细胞膜上形成非特异性的孔洞或损伤，促使细胞壁水解酶接近它的肽聚糖靶点，以此控制裂解酶在体内裂解细菌的时间。Holin/裂解酶共同作用的模型在肺炎球菌、金黄色葡萄球菌和乳酸菌中普遍存在［25］。

噬菌体裂解酶作为一种新型抗菌剂与活性噬菌体比较，最大的优点就是不能自我复制，易于定向操作，不产生抗药性;同时还具有高效快速、安全性高、基因修饰简单、应用前景好等优点。到目前为止，噬菌体裂解酶还处于实验室研究和临床实验阶段，裂解酶细胞壁识别位点的分子和基础结构了解得很少，而这是了解裂解酶如何降解细菌外膜的关键。Horgan 等［26］对裂解素的功能区域进行了进一步的研究，发现小的功能单位仍具有活性。

与活性噬菌体制剂一样，噬菌体裂解酶的应用同样受限于其特异性，因此扩大噬菌体裂解酶的杀菌谱仍然是一个需要解决的问题。噬菌体裂解酶由两个独立的结构域组成，N 端的催化结构域相对保守，C 端的细胞壁结合结构域决定其宿主特异性，通过不同噬菌体裂解酶之间结构域的交换重组可以改变裂解酶的宿主特异性或(和)裂解能力，可以基因工程技术交换重组裂解酶的不同结构域改变其作用范围或(和)提高其裂解活性。造成严重临床感染的很多致病菌是革兰阴性菌，如何对噬菌体裂解酶进行修饰，使其穿过外膜裂解肽聚糖，是利用裂解酶控制革兰阴性菌感染必须要解决的问题。使用裂解酶治疗细菌感染时，酶的耐药性和机体对酶的免疫应答反应也是目前面临的问题。

4 展 望

多重耐药细菌的出现和蔓延，正使人类面临无抗生素可用的危险境地，迫切需要研究新的抗菌制剂，噬菌体制剂对此提供了一种新的思路。噬菌体治疗细菌感染特别是多重耐药菌感染具有许多独特的优势，前景广阔。但噬菌体及其制剂真正广泛地应用于临床还面临诸多问题，如杀菌谱窄、全菌噬菌体的免疫原性、药代动力学、给药途径与剂量等等。为了噬菌体治疗细菌感染的安全性和有效性，我们需要对噬菌体在体内的药代动力学做更多的研究;可以利用分子生物学技术在分子水平上改造噬菌体，扩大其杀菌谱，敲除其毒性基因和耐药基因，使其应用更加广泛。在近年研究基础上，有理由坚信，使用噬菌体及其裂解酶在抗感染治疗方面将会取得更大的成功。

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