低氧诱导因子基因重组腺病毒载体的构建及其在内皮细胞中的表达

哈小琴，姜东红，邓芝云，董菊子，赵 勇，彭俊华，杨志华

(兰州军区兰州总医院检验医学中心，甘肃省干细胞与基因药物重点实验室，甘肃 兰州 730050)

低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是低氧时机体产生的一种重要的蛋白质调控因子。在低氧的条件下，HIF-1 是诱导细胞由有氧代谢向无氧代谢转换的重要因子［1］，同时通过影响其他因子的表达，直接参与缺氧组织内血管生成的全过程［2］。HIF-1 在缺氧、缺血状态下对组织细胞的保护作用逐渐受到关注，目前有关利用HIF-1 防治低氧损伤的研究已开始起步。在缺氧条件下，HIF-1 参与机体对缺氧的反应，调控细胞氧平衡和诱导缺氧基因的表达，迅速活化并诱导60 多种下游基因-低氧反应元件(hypoxia-responsive element)，其表达蛋白的功能包括了细胞存活、适应无氧代谢、免疫反应、细胞因子生成、血管新生以及维持内环境稳态等各个方面。当机体发生创伤、感染、休克、烧伤、外科手术、器官移植和处于高海拔地区时，以及其它一些严重疾病过程等应激因素都会导致血流灌流不足，引起缺血、缺氧，加重疾病的发生发展。而HIF-1 通过调节细胞的代谢模式，以无氧代谢适应缺氧环境和诱导新生血管生成以增加局部供氧等方式保护组织细胞减少损害。然而，在机体发生损伤时，内源的HIF-1 不足以满足机体维持体内环境的平衡，且其半衰期短，由此，我们设想通过基因治疗的策略，以作为基因治疗载体具有诸多优点的腺病毒为载体，通过细菌内同源重组法构建携带HIF-1α 基因的重组腺病毒，从而满足机体缺氧条件下对HIF-1 的需求，改善机体缺氧环境，并为进一步研究利用HIF-1α 防治缺氧缺血性疾病提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 载体质粒与细胞 pShuttle-CMV-EGFP 重组穿梭载体和pAdxsi 重组腺病毒骨架载体(北京诺赛基因组研究中心有限公司)，人胚肾细胞系HEK293 细胞、ECV304 细胞(ATCC)，DH5a 菌株。

1.2 主要试剂 限制性内切酶KpnI、BamHI、I-CeuI、I-SceI、XhoI 及Phusion 超保真DNA 聚合酶(美国New England Biolabs 公司);T4 DNA连接酶(深圳晶美生物工程有限公司);CIP(Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal)酶(美国Promega 公司);dNTPs、逆转录试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司);引物合成及测序(北京诺赛基因组研究中心有限公司);质粒小/中量提取纯化试剂盒、DNA 纯化试剂盒(柱离心型)、DNA 凝胶回收与纯化试剂盒［威格拉斯生物技术(北京)有限公司］;Middle DNA MarkerⅠ(上海鼎国生物技术有限公司);DNA Marker DL2000 (日本TaKaRa 公司);DMEM(美国Sigma 公司);胎牛血清(Hyclone公司);胰酶(美国Sigma 公司);真核转染试剂Lipofectamine 2000(美国Gibco);培养板、培养皿(康宁公司);氯化铯(美国Sigma);透析卡(Pierce 公司);人HIF-1 抗体购自北京博奥森生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记鼠抗人IgG 购自北京中山金桥生物有限公司。

1.3 构建重组穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF

1.3.1 HIF-1α cDNA 扩增获取 低氧处理A549 细胞后提取总RNA 并逆转录为cDNA(模板)，依据基因库公布的HIF-1α cDNA 设计引物，上游引物含 KpnI 酶切位点:CGGGGTACCATGGAGGGCGCCGGCGGC，下 游引物含BamHI 位点:CGCGGATCCTCAGTTAA CTTGATCCAA;用Phusion 超高保真DNA 聚合酶梯度扩增，PCR 反应体系:模板1.0μL，HIFKpnI-F(10μmol/L)2.5μL，HIF-BamHI-R(10μmol/L)2.5μL，dNTP(each 10μmol/L)1μL，5×Phusion HF Buffer 10μL，Phusion HF DNA ploymerase(2 U/μL)0.5μL，ddH2O 补齐至50μL;PCR 扩增程序:95℃5 min，95℃30 s，65℃30 s，72℃90 s，10个循环，每个循环降0.5℃，95℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，20个循环，72℃10 min。PCR 结束后加样至1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用DNA 凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)回收。将回收后的PCR 片段进行KpnI/BamHI 酶切处理，酶切结束后，用DNA 纯化试剂盒(柱离心型)回收得到含有相应粘性末端(KpnI/BamHI)的HIF-1α cDNA 片段。

1.3.2 酶切穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP 将pShuttle-CMV-EGFP 穿梭载体用KpnI/BamHI酶切，CIP 去磷酸化处理，酶切完成后加样至1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用DNA 凝胶回收与纯化试剂盒(柱离心型)回收5.1 kb 载体片段。

1.3.3 提取重组穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF将处理好的载体片段(pShuttle-CMV-EGFP KpnI/BamHI)和HIF-1α 插入片段(HIF-1α cDNA KpnI/BamHI)用T4 DNA 连接酶进行连接，取3μL 连接产物转化化学感受态细胞DH5a 菌株，涂布到卡那抗性固体LB 培养基平皿，37℃培养箱中培养过夜。挑取单克隆菌落，接种到卡那抗性液体培养基中，摇床中37℃300 r/min 振荡培养，提取质粒后双酶切(KpnI/BamHI)及测序鉴定。

1.4 构建重组腺病毒载体质粒pAdxsi-GFPHIF

1.4.1 酶切重组腺病毒骨架载体pAdxsi 用I-CeuI 和I-SceI 双酶切处理pAdxsi 载体，并做CIP 去磷酸化处理，待反应结束后酶切反应体系中加入10%SDS 75℃灭活10 min，用乙醇沉淀法回收载体。

1.4.2 鉴定重组腺病毒载体质粒pAdxsi-GFPHIF 用I-CeuI 和I-SceI 双酶切处理插入片段pShuttle-GFP-HIF，酶切完成后加样至1%的琼脂糖凝胶，电泳回收纯化目的片段。将上述处理好的载体片段和插入片段用T4 DNA 连接酶进行连接，取3μL 连接产物转化化学感受态细胞DH5a 菌株，涂布到氨苄抗性LB 培养基平皿，挑取单克隆菌落接种到氨苄抗性液体培养基中培养，小提质粒后用XhoI 酶切电泳鉴定。

1.5 纯化重组腺病毒

1.5.1 包装与鉴定重组腺病毒 将293 细胞接种于6 孔培养板中，每孔5×105个，置37℃含5%二氧化碳的培养箱中培养过夜。将鉴定正确的pAdxsi-GFP-HIF 用PacI 限制性内切酶线性化，转染当天细胞换新鲜培养基，用Lipofectamine2000 脂质体按其所附说明书进行转染，每天观察细胞出毒迹象，待细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。反复冻融3次后，800×g 离心5 min，收集含病毒的上清液即为毒种。用PCR 法鉴定腺病毒是否携带目的基因。

1.5.2 纯化重组腺病毒 用293 细胞大量扩增病毒。采用氯化铯不连续密度梯度离心法纯化病毒。测定OD260 并按照VP/ml=OD260×1.1×1012，计算得到每毫升制品中的病毒颗粒数(VP/ml)，测定OD260/OD280 比值检测病毒的纯度。用半数组织培养感染量(TCID50 值)法测定病毒制品的活性后-80℃保存。

1.6 检测内皮细胞中重组腺病毒pAdxsi-GFPHIF 将生长旺盛的ECV304 细胞以1×106个/孔接种于6 孔板，24 h 后弃去培养上清液，以前期工作中得出的最佳感染复数(MOI=100 pfu/cell)转染pAdxsi-GFP-HIF 病毒，转染24 h 和48 h 后荧光显微镜下观察细胞荧光表达，转染48 h ELISA 法检测培养上清液中HIF-1 蛋白含量。

2 结果

2.1 重组穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF 的鉴定经过酶切、连接、转化等步骤，将HIF-1α cDNA 克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP 中，获得重组穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF。重组质粒用KpnI/BamHI 双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，可见大小约2.5 kb 及5.1 kb 的两个基因片段，分别为pShuttle-GFP 质粒和HIF-1α。测序结果显示与基因库中序列一致。表明含HIF-1α cDNA 的重组穿梭质粒pShuttle-GFPHIF 已成功构建。

2.2 重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-HIF 的鉴定经过酶切、连接、转化等步骤，将穿梭质粒pShuttle-GFP-HIF 中的GFP-HIF 克隆至pAdxsi腺病毒骨架载体上，获得重组腺病毒质粒pAdxsi-GFP-HIF。根据重组后腺病毒载体的序列分析携带目的基因表达框的阳性克隆被XhoI 酶切后由8 条带组成:14.50 kb、11.70 kb、2.66 kb、2.60 kb、2.48 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.60 kb(图2)，其中2.66 kb/2.60 kb 和2.48 kb/2.47 kb 可能重叠将无法区分。没有重组目的基因的腺病毒空载体由以下6 条带组成:14.00 kb、11.80 kb、4.00 kb、2.47 kb、1.45 kb、0.66 kb(图3)。

2.3 重组腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 的效价 用Lipofectamine 2000 脂质体将pAdxsi-GFP-HIF转染HEK293 细胞10 d 后，观察到细胞变大变圆，呈现明显的细胞病变效应，并开始出现中间区域细胞变圆、漂浮、边缘细胞不规则收缩的噬斑。多次感染后获得大量病毒，病毒颗粒数为9.46×1011/mL，OD260/OD280 比值为1.33，病毒的感染效价为3.38×1010pfu/mL。

2.4 重组腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 在内皮细胞中的表达 将纯化的重组腺病毒pAdxsi-GFPHIF 转染ECV304 细胞24 h 后，在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达(图4A)，48 h 时荧光更强(图4B);转染48 h 培养上清液中HIF-1 蛋白表达水平为(48.93±3.86)ng/mL。

图1 pShuttle-GFP-HIF KpnI/BamHI 酶切鉴定结果Fig.1 Results of pShuttle-GFPHIF KpnI/BamHI digested identification

图2 pAdxsi-GFP-HIF XhoI 酶切鉴定结果Fig.2 Results of pAdxsi-GFPHIF XhoI digested identification

图3 pAdxsi 空载体XhoI酶切鉴定结果Fig.3 Results of pAdxsi empty vector XhoI digested identification

图4 重组腺病毒pAdxsi-GFP-HIF 转染ECV304 细胞后荧光显微镜检测结果Fig.4 ECV304 cells transfected with recombinant adenovirus pAdxsi-GFP-HIF were examined by experion system

3 讨论

1992年Semenza［3］在人的Hep 3B 细胞株的核提取物中发现一种蛋白质，这种蛋白能特异性地结合于红细胞生成素基因增强子的寡核苷酸序列，后来发现该蛋白可调控多种低氧反应基因的转录，参与低氧反应信号传导过程，故命名为HIF-1［4］。随着对其研究的不断深入，在实验中发现其与缺血/低氧状态下机体的各种应答机制关系密切［5］。

HIF-1 主要以异源二聚体的形式存在，其中HIF-1α 是调节亚基，对低氧非常敏感，受氧浓度的影响表达差异较大，所以在功能调控方面起关键作用，决定HIF-1 的活性［6］。在氧浓度低于6% 时(相当于氧分压在46 mmHg)，HIF-1α 成倍增加，迅速达到最大值，并与HIF-1β 形成结构稳定的HIF-1 分子。HIF-1α 随着缺氧时间的延长而被大量激活。HIF-1α 属于碱性螺旋-环-螺旋蛋白，且含有PAS 结构域，为bHLH-PAS 超家族成员，在机体组织缺氧的状态下表达增加，促进血管生成［7］。HIF-1α 可与含有低氧反应元件和顺式作用转录调节序列的靶基因结合，从而激活靶基因的转录。迄今发现HIF-1α 的靶基因有几十个，分别在器官、组织、细胞水平的低氧适应反应过程中起重要作用，血管生成是组织适应低氧环境的一个重要方面，与HIF-1α 高度相关［8］。HIF-1α 对血管生成的影响主要是通过调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来完成的［9］。在HIF-1 的刺激下VEGF 及其受体表达增加，VEGF 对缺血缺氧组织的保护作用主要通过以下几个途径:(1)VEGF 促进内皮细胞的增殖和血管生成，改善局部血供［9］。同时VEGF 还能在内皮细胞中诱导抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，抑制凋亡蛋白caspase-3 的表达，维持内皮细胞的生存［10］。此外，VEGF 还能刺激内皮细胞迁移，防止血管再狭窄的发生［11］。(2)VEGF 增加血管尤其是微小血管通透性的作用较强，使血浆大分子外渗沉积在血管外的基质中，为细胞的生长和新生毛细管的建立提供营养［12］。基于此，若在缺血低氧组织局部给予HIF-1α 以防治其损伤具有非常重要的意义。

由于直接应用HIF-1α 蛋白制剂存在蛋白半衰期短，需要大量、反复应用才能维持局部较高的HIF-1α 浓度的弊端，且生产符合临床用蛋白制剂工艺复杂、成本较高，所以本实验采用基因治疗的策略，将HIF-1α 基因克隆至腺病毒载体中，单次应用重组腺病毒后使局部转染细胞作为一“微型药物工厂”可持续一定时间分泌表达HIF-1α 活性蛋白，一次转染后在缺氧缺血的局部持续一段时间发挥HIF-1α 作用。

本研究中构建HIF-1α 基因转移载体时选用腺病毒载体，原因是腺病毒载体具有感染细胞效率高、宿主范围广、不整合入细胞基因组、可插入片段容量大、容易制备高效价病毒、遗传毒性较低、细胞毒性较低、免疫原性弱等优势［13］，且已被广泛用于基因治疗研究和临床试验中［14-15］。本研究成功构建了携带HIF-1α 基因的重组腺病毒pAdxsi-GFP-HIF，其扩增、纯化后的重组病毒纯度好、效价高，以100 MOI 转染ECV304 细胞后其转染效率及目的基因的蛋白表达水平均较高，因此可在缺血缺氧组织局部，具有潜在的应用前景。

［1］SINGH N，SHARMA G，MISHRA V.Hypoxia inducible factor-1:its potential role in cerebral ischemia［J］.Cell Mol Neurobiol，2012，32(4):491-507.

［2］NDUBUIZU O I，TSIPIS C P，LI A，et al.Hypoxiainducible factor-1(HIF-1)-independent microvascular angiogenesis in the aged rat brain［J］.Brain Research，2010(1366):101-109.

［3］SEMENZA G L，WANG G L.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhance at a site required for transcriptional activation［J］.Mol Cell Biol，1992，12(12):5447-5454.

［4］WANG G L，SEMENZA G L.General involvement of hypoxia inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia ［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(9):4304-4308.

［5］ZHANG Q，QIAN Z，PAN L，et al.Hypoxiainducible factor 1 mediates the anti-apoptosis of berberine in neurons during hypoxia/ischemia［J］.Acta Physiol Hung，2012，99(3):311-323.

［6］BERGERON M，GIDDAY J M，YU A Y，et al.Role of hypoxia-inducible factor-1 in hypoxia-induced ischemic tolerance in neonatal rat brain［J］.Ann Neurol，2000，48(3):285-296.

［7］YUAN Y，ZHONG H(袁 源，钟 竑).Progress of structure and function of hypoxia-inducible factor-1［J］.Progress in Modern Biomedicine(现代生物医学进展)，2010，(5):961-963.(in Chinese)

［8］WANG G L，SEMENZA G L.Characterization of hypoxia-inducible factor 1 and regulation of DNA binding activity by hypoxia ［J］.J Bio Chem，1993，268(29):21513-21518.

［9］DALEPRANE J B，SCHMID T，DEHNE N，et al.Suppression of hypoxia-inducible factor-1α contributes to the antiangiogenic activity of red propolis polyphenols in human endothelial cells［J］.J Nutr，2012，142(3):441-447.

［10］OLADIPUPO S，HU S，KOVALSKI J，et al.VEGF is essential for hypoxia-inducible factor-mediated neovascularization but dispensable for endothelial sprouting［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(32):13264-13269.

［11］NOR J E，CHRISTENSEN J，MOONEY D J，et al.Vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis is associated with enhanced endothelial cell survival and induction of Bcl-2 expression［J］.Am J Pathol，1999，154(2):375-384.

［12］TANG C，WANG G，WU X，et al.The impact of vascular endothelial growth factor-transfected human endothelial cells on endothelialization and restenosis of stainless steel stents ［J］.J Vasc Surg，2011，53(2):461-471.

［13］SHIBUYA M.Vascular endothelial growth factor and its receptor system:physiological functions in angiogenesis and pathological roles in various diseases［J］.J Biochem，2013，153(1):13-19.

［14］KIM J W，GLASGOW J N，NAKAYAMA M，et al.An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer［J］.PloS One，2013，8(2):e55533.

［15］CHANG Y，LI Y，HU J，et al.Adenovirus vectormediated expression of TMEM166 inhibits human cancer cell growth by autophagy and apoptosis in vitro and in vivo ［J］.Cancer Lett，2013，328(1):126-134.

［16］YAO X，YOSHIOKA Y，MORISHIGE T，et al.Tumor vascular targeted delivery of polymerconjugated adenovirus vector for cancer gene therapy［J］.Mol Ther，2011，19(9):1619-1625.