氯沙坦对晚期糖基化终产物诱导足细胞α-actinin-4表达的干预作用

成彩联 郑振达 石成钢 叶增纯 李灿明 娄探奇★

2.中山大学附属第三医院心内科，广东，广州 510630

足细胞是附着在肾小球基底膜外侧高度分化的细胞，足细胞和足突间的裂孔隔膜是构成肾小球滤过膜的最后一道屏障，多种重要的足细胞相关蛋白异常与蛋白尿的发生密切相关。晚期糖基化终产物（advanced glycation end-products，AGEs）是高糖环境下的重要产物，参与糖尿病肾病的发生发展。Mundel等[1,2]认为足细胞的细胞骨架破坏可引起足突融合，导致裂孔隔膜结构消失，并破坏滤过膜的完整性，出现蛋白尿。本研究旨在观察AGEs对足细胞骨架相关蛋白α-actinin-4的影响，并进一步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

本研究采用的小鼠原代培养足细胞株MPC5由中山大学余学清教授惠赠。选用德国 Merck的AGEs，美国MP Biomedicals的细胞培养级牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA），美国 Proteintech Group的兔抗大鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体，美国Sigma-Aldrich的兔抗α-actinin-4多克隆抗体、小鼠γ–干扰素、氯沙坦（Losartan）和结晶紫，美国Invitrogen的Rhodamine鬼笔环肽，美国Jackson ImmunoResearch的DyLight 488山羊抗小鼠IgG，以及德国META ZEISS的激光共聚焦显微镜LSM510。

1.2 细胞培养及实验分组

在33℃培养箱里，把足细胞放入含10 U/mLγ–干扰素（美国Sigma）10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中传代培养，然后转至不含γ–干扰素的10%胎牛血清RPMI 1640培养液，在37℃分化10～14天，取分化成熟的足细胞进行实验。实验分为不同浓 度 的 AGEs组（0，20，40，80 μg/mL）和 BSA 组，用Western blot及免疫荧光技术检测α-actinin-4和F-actin，经氯沙坦预处理后，观察α-actinin-4和F-actin的改变。

1.3 Western blot

按说明书提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，兔抗鼠α-actinin-4（1︰200），辣根过氧化物酶标记二抗（1︰60000）室温孵育1 h，TBST洗3次，显影、定影。用BioRad扫描仪扫描胶片，应用Quantity One图像分析软件对特异性条带进行灰度扫描，以目的蛋白条带与GAPDH 蛋白条带灰度值的比表示其相对含量。

1.4 免疫荧光共聚焦检测

将0.1% 明胶溶液包被盖玻片放入六孔板中，加入等量消化好的细胞悬液，待其贴壁生长至70%左右，同步化过夜，加处理因素培养24 h，依次经4%多聚甲醛固定，0.25% Triton X-100打孔，封闭，孵育一抗α-actinin-4（1︰100）和 Rhodamine鬼笔环肽，孵育DyLight 488山羊抗小鼠IgG（1︰1000），Hoechst 33342染核，滴少量抗荧光淬灭剂，指甲油封边，激光共聚焦显微镜下观察结果并扫描采集图像。

1.5 统计学方法

所有数据均代表3次以上重复实验结果，以均数±标准差表示。采用SPSS16.0统计软件，多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA方法，两两比较采用LSD方法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度AGEs对足细胞α-actinin-4的影响

不 同 浓 度 的 AGEs（0，20，40，80μg/mL）干预小鼠的足细胞24 h后，用western blot法检测α-actinin-4的蛋白表达，结果显示：与对照组比较，AGEs（80μg/mL）能明显下调足细胞α-actinin-4的表达（P＜0.05），而BSA对α-actinin-4的蛋白表达没有明显影响（P＞0.05），见图 1、表 1。

图1 不同浓度AGEs对足细胞α-actinin-4的影响Figure 1 Effects of advanced glycation end products on α-actinin-4 expression in podocytes

表1 AGEs对足细胞α-actinin-4表达的影响Table 1 Effect onα-actinin-4 expression with different concentration of advanced glycation end products in podocytes

2.2 氯沙坦对AGEs介导α-actinin-4的影响

小鼠足细胞经氯沙坦（100μmol/L）预孵育60 min后，加入AGEs（80μg/mL）作用24 h，结果显示：AGEs能明显下调α-actinin-4的表达（P＜0.05），氯沙坦预处理能明显减轻AGEs介导的α-actinin-4的下调程度（P＜0.05），见图 2、表 2。

图2 氯沙坦对AGEs介导α-actinin-4的影响Figure 2 Effects of losartan on α-actinin-4 expression induced by advanced glycation end products in podocytes

表2 氯沙坦减轻AGEs介导的足细胞α-actinin-4的下调Table 2 Losartan alleviated the downregulation of α-actinin-4 induced by advanced glycation end products in podocytes

2.3 氯沙坦对AGEs介导的足细胞骨架蛋白重构的影响

小鼠足细胞经氯沙坦（100μmol/L）预孵育60 min后，加入 AGEs（80 μg/mL）作用 24 h，激光共聚焦显微镜结果显示：AGEs引起α-actinin-4从膜周向胞核、核周迁移，F-actin从有序的平行状纤维束重构为杂乱无序的网状物；氯沙坦预处理能减轻AGEs介导的的α-actinin-4的重分布，减少F-actin的重构，见图 3。

图3 AGEs对足细胞骨架蛋白重构的影响（×630）Figure 3 Effects of advanced glycation end products on cytoskeleton reorganization (×630)

3 讨论

足细胞损伤在糖尿病肾病的发病中起着重要的作用，AGEs可直接作用于肾小球的足细胞，导致足细胞的凋亡、脱落。足突细胞骨架主要由F-actin组成，synaptopodin和α-actinin-4将F-actin连接在一起。足突的任何一个结构域发生功能障碍，都将引起肌动蛋白从并联的收缩蛋白束变成致密的网状结构，并伴有足突融合和蛋白尿。有研究发现用白藜芦醇稳定足细胞骨架蛋白α-actinin-4的表达，可阻止TGF-β1诱导的足细胞的凋亡[3]。因此阐明足细胞骨架重构的机制对于足细胞的防护具有重要的意义。

α-actinin-4是一种肌动蛋白微丝交联蛋白，能将松散的肌动蛋白纤维捆扎成具有收缩作用的纤维束，具有调节足突机械动力的作用。α-actinin-4同时和大量的细胞骨架、细胞表面及信号传导分子相互作用。α-actinin-4在胞内一方面与基底膜的整合素复合物相作用，另一方面又能与裂孔隔膜复合物相连，从而将足细胞的两个部分连接在一起，提示α-actinin-4在上皮细胞足突末端的肌动蛋白微丝与整合素的锚定中起重要作用。

本研究通过以不同浓度的AGEs干预小鼠足细胞24 h，结果发现，80 μg/mL AGEs能明显下调α-actinin-4的表达，并使α-actinin-4从膜周向胞浆内、核周迁移，足细胞F-actin肌动蛋白由平行排列的纤维束变为杂乱无序的网状物。α-actinin-4的减少和F-actin的重构导致细胞从稳定表型转变为迁移表型，细胞的迁移性增加，导致骨架蛋白的高转运，消耗能量，终使足细胞脱落。有研究发现糖尿病肾病肾组织α-actinin-4表达下降与蛋白尿和肾小球病变密切相关，α-actinin-4的改变会导致滤过屏障破坏、足突的消失和蛋白尿，并逐渐出现肾小球硬化、肾衰竭和动物死亡，而且异常表达的α-actinin-4与肌动蛋白纤维丝的结合力增强形成聚合体，变得不稳定且容易被蛋白酶降解，并促进足细胞的凋亡[4～5]。Dandapani等[6]发现先天α-actinin-4缺乏小鼠与野生鼠相比，每个肾小球足细胞的数量减少，整合素磷酸化减少，而且在压力不断增加的情况下，足细胞黏附于基底膜的能力下降，提示肌动蛋白细胞骨架可通过影响足细胞的结构或功能，参与蛋白尿的发生和发展。这些研究结果提示α-actinin-4的减少与足细胞的损伤、蛋白尿的发生、肾小球的硬化均有密切关系。

足细胞肌动蛋白骨架处于动态变化中，早期足细胞的形态改变，如足突融合、裂孔隔膜断裂是可逆的，持续性损伤将导致足细胞凋亡或从基底膜上脱落，最终进展为肾小球硬化和终末期肾衰竭。如果能在一定时间内去除损伤因素，则重构的骨架蛋白会恢复，足细胞的功能改善。因此，研究细胞骨架重构的调节机制对于足细胞的防护具有重大的意义。Mifsud等[7]研究发现缬沙坦可减轻链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠肾小球基底膜裂孔隔膜的单位长度，保护了足突的结构。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂虽然广泛应用于肾脏疾病的治疗，但对足细胞骨架蛋白的影响研究不多。因此，观察其对足细胞在肾小球疾病过程中的病变作用及其机制的深入了解，必将为肾小球硬化的防治研究开辟广阔的前景。我们观察了血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂氯沙坦对AGEs介导足细胞骨架蛋白的影响。结果发现，氯沙坦预处理足细胞后，AGEs介导的α-actinin-4的下调程度明显减轻，α-actinin-4的重分布减少，F-actin重新恢复为平行排列状。有研究[8]发现Ang Ⅱ通过氧化应激激活rac1和ezrin/radixin/moesin（ERM）通路促使肌动蛋白细胞骨架的重构。这些结果提示足细胞内的肾素-血管紧张素系统激活可能参与了AGEs介导的足细胞骨架蛋白的重构和迁移性，减轻AGEs对足细胞骨架的影响可能是氯沙坦减少蛋白尿的另一作用机制。

综上所述，我们的结果发现，AGEs可以下调α-actinin-4的表达并介导骨架蛋白的重构，而氯沙坦预处理可减轻AGEs介导的足细胞的这些损伤性变化。足细胞组成肾小球滤过膜的最后一道屏障，其损伤不但导致蛋白尿的出现，而且是肾小球硬化的核心环节。阐明足细胞损伤的分子机制，对于寻求更为有效的治疗方法，阻止肾小球疾病的慢性进展，进而改善慢性肾脏病患者的生存质量有重大意义。

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