多靶标基因并行检测技术为肿瘤个体化治疗提供新模式

蔡贞 郑磊

•述 评•

多靶标基因并行检测技术为肿瘤个体化治疗提供新模式

蔡贞 郑磊★

随着人类基因组学和药物基因组学的发展，肿瘤个体化诊疗已由愿景变成了现实。肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多信号通路激活的复杂生物学过程，多靶标并行检测可一次同时对多个肿瘤个体化诊疗相关靶标进行检测，为临床医生制定适宜的个体化诊疗方案提供更为全面的信息。本文仅就近年出现的可实现多靶标并行检测的主要技术-液相芯片技术和新一代测序技术做简要的述评，并简述多靶标并行检测在质量控制方面应遵循的基本原则。

肿瘤；个体化诊疗；多靶标并行检测技术

1 肿瘤个体化诊疗

近20年我国恶性肿瘤的发病率升高约50%，成为疾病死亡原因之首。虽然恶性肿瘤诊治近年来已取得长足的进展，但大部分肿瘤患者预后情况仍无显著改善。手术切除、局部放疗和辅助化疗联合应用仍是恶性肿瘤的主要治疗手段。传统的肿瘤化疗用药方案主要根据患者罹患肿瘤的临床分期和病理分型制定，剂量的个体化差异则根据体重、体表面积、肝肾功能等做相应的调整。这种用药策略对不同患者产生的治疗效果可分为四种：治疗有效而无副作用；有效有副作用；无效也无副作用；无效而有副作用。对于无效或存在严重副作用的患者，往往存在一个确诊、试药、换药、再换药的过程，这样不仅造成病情延误，还增加了患者承受毒副作用及经济损失的几率。随着肿瘤生物学研究的进展，一些与抗肿瘤药物疗效相关的靶信号通路、靶点基因甚至某一基因的多态性位点逐渐明确，推动了肿瘤个体化治疗的发展。

肿瘤个体化治疗是指在患者确诊后进行药物疗效相关的基因检测，根据基因检测的结果确定个体化治疗方案。美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）发布的几种恶性肿瘤临床实践指南中已明确提到对于恶性肿瘤的病理学评估不仅要确定组织学类型、侵犯范围、明确手术切缘情况等，还需要进行必要的分子学诊断检查，目的是确定是否存在特定的基因突变（如EGFR、K-ras等）以选择靶向药物治疗的适宜人群，或对患者选择适宜的治疗方法提供参考。但在临床实践中，肿瘤医生仍常常感到困惑：“我们知道每个患者不一样而且需要进行个体化治疗，但我们怎样能知道他们有什么不一样，又如何根据这些不一样来实施个体化治疗？”随着人类基因组学和药物基因组学的发展，肿瘤“分子分型”概念被广泛认可，并在肿瘤个体化治疗中发挥着越来越重要的作用。与传统的病理分型不同，恶性肿瘤分子分型是根据基因特征将患者进行分类。以肺癌为例，传统病理分型根据组织细胞形态分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），后者又可分为腺癌、鳞癌和大细胞癌等；而分子分型则根据EGFR、K-ras、ALK融合基因状态，将患者分为不同的亚群，如图1。针对不同分子分型的肺癌实施针对性治疗，可显著地提高治疗有效率[1～2]。MD Anderson肿瘤研究中心就肺癌个体化治疗开展的数个大型前瞻性临床研究均显示了个体化治疗的可行性及优势[3～4]。

2 多靶标并行检测的必要性

肿瘤的发生发展是一个多因素作用、多基因参与、多信号通路激活的极其复杂的生物学过程。近年的肿瘤基因研究发现，每个肿瘤均可通过靶标检测明确其驱动变异基因，根据变异基因即可将患者归为某分子亚型，从而针对性实施治疗[5～7]。靶向药物（targeted medicine）针对肿瘤基因开发，通过与癌症发生、肿瘤生长所必需的特定分子靶点的作用，阻断肿瘤细胞内控制细胞生长增殖的信号传导通路杀灭癌细胞，阻止其进展，是目前最先进的用于治疗癌症的药物。靶向药物通过特定靶位发挥治疗作用的本质特性，决定了任何一种靶向药物只对部分患者有效。靶标基因检测是筛选适合特定靶向药物治疗患者的重要手段，已成为实施肿瘤个体化治疗的必需部分，但靶向药物疗效产生影响的因素往往涉及到某一特定信号通路中的多个关键基因。在一项对747位接受西妥昔单抗治疗的结直肠癌患者EGFR通路基因突变进行检测的研究中，研究者检测了包括K-ras、BRAF、NRAS和PIK3CA共71种突变。结果表明患者总缓解率为24.4%，而K-ras、BRAF、NRAS和PIK3CA均为野生型患者的缓解率为41.2%[8]，这一结果表明通过检测EGFR通路系列靶标检测结果筛选，能使西妥昔单抗的有效率提高近70%；与检测单一靶标相比较，检测信号通路所有成员，对实施个体化治疗更有指导意义。而对于NSCLC患者，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）厄洛替尼和吉非替尼是目前治疗NSCLC临床应用最广的靶向治疗药物，患者肺癌细胞EGFR基因突变状态是这类药物疗效的决定因素。根据NCCN非小细胞肺癌临床实践指南，NSCLC患者EGFR突变阳性者应首选TKIs药物治疗，而EGFR野生型，选用细胞毒化疗。但肺癌细胞如存在K-ras基因突变会导致TKIs治疗耐药状态，如明确患者存在K-ras突变，则需考虑厄洛替尼以外的治疗方法。此外，NSCLC患者中还存在EML4-ALK突变亚群，EML4-ALK突变阳性患者虽然对EGFR-TKIs耐药，但ALK抑制剂如克唑替尼对这类患者的一种很有效的治疗策略，显示出非常高的疾病控制率（约90%）。故而NCCN指南中明确建议NSCLC患者进行靶向治疗应检测以下几种生物标记物，包括：EGFR、K-ras、EML4-ALK融合癌基因等；此外ERCC1、RRM1等基因mRNA表达水平等可作为化疗疗效预测标记物[9～11]。综上而知，单一检测某项靶标对患者接受治疗的指导意义存在明显局限，通过多通路多靶标并行检测获得每位患者肿瘤的全面基因信息，才能为患者制定出针对这些驱动基因的最佳药物组合，如图1所示[12～24]。随着肿瘤信号通路研究的深入，将有更多与药物疗效相关的靶标被揭示，并使药物治疗效率进一步提高。

图1 肺癌个体化治疗分子分型Figure 1 Molecular pathology of non-small cell lung cancer

3 多靶标并行检测技术平台

目前常用的基因突变检测技术有测序法、DHPLC法、ARMS法和生物芯片技术等。其中第一代测序技术、ARMS、DHPLC等都无法实现多个靶标并行检测而只能分开多次进行，这样会导致以下问题出现：（1）使用样本量成倍递增；（2）增加系统误差；（3）检测过程耗时，且费用昂贵，难以实现规模化。生物芯片技术（biochip/bioarray）和新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）的发展使得多种肿瘤个体化诊疗相关靶标并行检测得以实现。

3.1 生物芯片技术

生物芯片是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之一，其原理是根据生物分子间特异性的相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质以及其他生物成分的高通量快速检测。根据载体性质的不同，可分为固相芯片技术和液相芯片技术。前者是将多种待测分子靶标预置在一款很小的固相支持物上，用于俘获被测血清中对应的待测分子，通过检测杂交信号，对生物细胞或组织中检测分析的信息进行定量分析。第一张进入临床检查的是Amplichip CYP450 SNP检测芯片，于2005年通过了FDA批准进入临床使用，用来检测患者体内决定细胞色素氧化酶活性的多态性位点以预测患者药物代谢水平的高低。目前固相芯片的制备逐渐走向高通量、微量化和自动化，其检测下限也已达到纳克级总RNA水平。这为多靶标并行检测研究，即在同一个芯片载体上平行地进行多个序列的杂交提供了可能。此外，芯片矩阵面积的微量化也减少了样品用量，大大减少了系统和批次可能带来的差异。

液相芯片（liquid chip) 则以荧光微球为载体，集合流式细胞技术、激光技术、数字信号处理技术及传统芯片技术于一体，由美国Luminex公司首先提出并研制成功。该技术利用包覆不同比例红光及红外光发色剂产生的几百种不同比例颜色（荧光编码）的聚苯乙烯微珠（直径5.5～5.6 μm），通过标定特定抗体、核酸探针与各种受体等，与biotin标记的待测样本反应后，逐个通过检测通道并使用双色激光检测：红色激光激发微珠基质上的红色分类荧光，根据微珠中的荧光编码分类，鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光则激发绿色报告荧光分子，确定微珠上结合的报告荧光分子数量来确定目的分子数量（即定量），最终对靶标实现实时、定性和定量分析。与固相芯片相比，液相芯片具有操作简便，标本用量少、线性范围广、准确度高的优点。此外，液相芯片还可根据临床的需要自由选择不同的检测靶标进行组合[25]。目前基于其开发的应用于肿瘤个体化诊疗的技术包括分支DNA液相芯片技术、xTAG液相芯片技术和MEL液相芯片技术。其中分支DNA液相芯片技术直接采用样品裂解液检测待测RNA分子含量，与传统的基因mRNA检测技术-逆转录PCR相比，省略了DNA提取、逆转录及目标片段扩增等步骤，降低了操作过程或多步骤误差积累对结果的影响，对于FFPE样品尤其适用[26，27]。分支DNA液相芯片可一次并行检测36种靶标，主要用于化疗疗效相关基因RNA表达水平检测和肿瘤预后相关靶标检测[28～30]。xTAG-液相芯片技术可同时检测体细胞基因突变和基因多态性，具有灵敏度高、特异性好和损耗样本量少等特点，适用于各种组织样本和全血样本等。xTAG-液相芯片技术一次反应可同时检测96个样本的70个等位基因，最低可检测占野生型拷贝数1%的突变片段[31,32]。MEL（突变富集）液相芯片技术检测则特别适用于胸水、血浆等样本中游离肿瘤DNA或经显微切割的组织切片样本的体细胞突变检测[33]，最低可检测占野生型拷贝数0.1%的突变片段。

3.2 新一代测序技术

DNA测序技术始于上世纪七十年代，由于测序技术可较直观地分辨出基因的核酸突变、插入和重排等变异，在检测靶基因的核酸序列中具有独特的优势，在肿瘤靶向药物的选择与分子分型等领域已得到广泛应用。第一代测序技术即双脱氧链末端终止法或称Sanger测序法是目前应用最为广泛的DNA测序技术，具有读序列能力较长（大于1 000 bp）、准确率高（可以达到99.99%）、操作与结果分析简易等优点。其缺点是操作步骤繁琐，技术要求高，且要求检测样本中基因突变达到一定比例方可检出。经过30多年的发展，测序技术也经历了技术的演变。近年开展的如火如荼的新一代测序技术以一次能并行对几百万到十亿条DNA分子进行序列测定为特点，亦为多靶标并行检测提供了技术平台[34]。高通量测序平台的代表有罗氏公司的454测序仪、Illumina公司的Solexa基因组分析仪、ABI的SOLID测序仪和Ion Torrent系统，以上几种测序技术依赖PCR扩增的信号放大过程，基于边合成边测序的原理，突出特点是测序的高度平行化，成千上万个测序反应可在同一系统内同时进行，且反应体系非常小，可在短时间内获得大量的核酸序列信息。以454测序技术为例，其基本原理是：首先将核酸样本打断成数百bp的片段，通过在其末端接上接头形成样品文库，并与特别设计的磁珠相连接，此时每个磁珠携带有独特的核酸片段，再将磁珠进行乳化PCR反应（Emulsion PCR），那么每个DNA片段将形成一个独立的核酸扩增反应，最后再将带有扩增产物的磁珠放入特定的微孔板中进行焦磷酸测序与数据分析。2010年面市的Ion torrent测序平台则基于半导体技术原理而非光学原理进行测序，为全球首个后光学时代的基因组测序平台[35]。而Helicos公司的Heliscope技术、Pacific Biosciences公司的SMRT技术被誉为第三代测序技术，真正实现了无需文库构建的单分子测序，不但简化了基因组测序的流程，且大大降低了所需样品的量。随着高通量测序技术的发展与逐渐成熟，科学家们不断在基因组水平上对疾病进行更深入的研究探索，并已在一些罕见病、遗传病和癌症的诊断治疗中取得突破，相信在不久的将来，高通量测序技术将会为个体化医疗提供更丰富有力的诊疗信息。

4 多靶标检测的质量控制

多靶标检测往往包括基因扩增PCR和核酸杂交过程，其质量控制应遵循临床检验，特别是临床基因扩增实验室的质控原则进行质量控制和质量管理。除此之外，多靶标检测还有一些特殊的质量控制考虑。分析前往往是样本检测中最难控制的环节。肿瘤靶标检测的标本多为组织标本中的DNA或RNA分子，针对不同检测方法不同检测物质，对于标本采集、运送和采集的过程均有其特殊要求。如用于提取核酸的血液标本，通常要求使用EDTA抗凝的采血管，其它抗凝剂可能会对后续PCR扩增效率造成影响；又如检测的靶核酸是RNA时，要求标本必须在保护液中保存运输以免RNA降解[36]。所以必须建立标准化流程，并对标本采集和运送人员进行培训。在分析过程中，质控品是及时发现检测异常的监控手段，其合理设置尤为重要。检测的各个关键过程均应设置质控样本，包括核酸提取过程、检测过程和关键仪器性能表现等[37～38]，此外由于检测靶标的特殊，很多个体化诊疗靶标基因的表达水平在不同个体中原本就存在很大差异，加之应用检测方法的不同，故而针对不同检测靶标需设置严密合理的内参对照，包括不同种类、不同浓度的内参设置等以保证结果的可信性。肿瘤个体化诊疗相关靶标检测的分析后质量控制，除了可以采用Levey-Jennings质控图和Westgard多规则质控方法等常用统计学分析外，还可以定期回顾分析靶标突变率、靶标突变的人口学分布等指标是否在研究支持的合理范围内。另外，由于个体化诊疗尚处于临床发展初期，对于一些靶标与疾病或药物疗效的相关度仍需大样本临床观察，尤其是针对国人的大样本量数据。加强与临床医生的对话，与临床医生一同合理分析报告，对正确地运用检测结果很重要。

5 结语

肿瘤治疗正逐步进入个体化治疗时代。近年来肿瘤相关靶标的研究进展非常迅速，新的检测技术亦层出不穷。将新研究成果和先进技术转化并服务于临床，必须尽快建立规范、标准化的临床检测方法，并建立配套的质量控制体系。

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Multiple target gene detection technologies provide a new dimension for personalized cancer therapy

CAI Zhen, ZHENG Lei★
(Laboratory Medicine Center, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

Along with the development of human genomics and pharmacogenomics, the personalized diagnosis and treatment of cancer has translated from vision into reality. The occurrence and development of malignant tumors is a complicated biological process involving multiple genes and signaling pathways. Parallel detection technologies are capability of detection of multiple target genes simultaneously, which provide more comprehensive information for clinical doctors to make personalized treatment program. This article will briefly introduce the new developed multiple target genes parallel detection technology, liquidchip technology and next-generation sequencing technology and discuss the basic principles of quality control involved in these technologies.

Tumor; Personalized diagnosis and treatment; Parallel detection technology of multiple target genes

国家自然科学基金（81101609）；广东省自然科学基金（S2011010003840）；广东省医学科研基金（A2013375）；国家特色专业临床检验（TS2483）

南方医科大学南方医院检验医学科，广东，广州 510515

★通讯作者：郑磊，E-mail:nfyyzl@163.com