IL-17和IFN-γ在红内期间日疟原虫感染者外周血T细胞亚群中的表达

孔评石夏惠

IL-17和IFN-γ在红内期间日疟原虫感染者外周血T细胞亚群中的表达

孔评石1,2夏惠2★

目的 观察分析间日疟原虫感染患者外周血T细胞亚群中分泌IL-17和IFN-γ的细胞的表达水平。 方法 采用流式细胞术检测分析患者组（PV）和健康对照组（HD）外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD8-和γδT细胞中分泌胞内因子IL-17、IFN-γ的细胞的百分比。 结果 在所有检测的细胞亚群中，分泌IFN-γ的CD3+CD8-和γδT细胞在其所属亚群中所占比例明显高于健康对照组，分泌IL-17的γδT细胞的比例明显高于健康对照组。 结论 本研究对于理解机体抗疟原虫的细胞免疫的功能状态具有一定意义。

IL-17；IFN-γ；γδT细胞；间日疟原虫1,22★

疟疾是危害人类最严重的寄生虫病。尽管近年来疟疾防治工作取得了重要进展，但恶性疟原虫（Plasmodium falciparum，Pf）每年仍造成数十万患者死亡[1]。间日疟是最广泛传播的虫种，亦是我国主要的流行虫种，但长期以来对间日疟的免疫机制研究不够深入。

疟疾的抗感染免疫机制中存在着复杂的细胞因子效应。在以往的研究中表明IFN-γ、TNF-α、IL-12、 IL-6等多种细胞因子在抗疟原虫感染中发挥了重要作用，其中IFN-γ在抗疟原虫感染和免疫调节中发挥了重要的调节作用。近年来，IL-17在感染免疫中的作用受到越来越多的认识，但在疟疾感染中的表达状况却少见报道。本研究通过对间日疟原虫红内期现症感染者外周血T细胞亚群分泌IL-17和IFN-γ的特征进行观察分析，旨在了解间日疟感染中的细胞因子表达特征，从而进一步理解间日疟感染中细胞免疫和调节的机制。

1 资料与方法

1.1 实验对象

24例间日疟患者（PV）全血采自蚌埠市周边县区医院。患者经镜检诊断为红内期间日疟原虫感染，用肝素抗凝管抽取血样于37℃保温4 h内送达实验室，经镜检复检确认的血样用于实验。23例健康志愿者（HD）外周血取自蚌埠医学院学生和教师。所有人群均排除肝炎与结核病史。

1.2 主要试剂和设备

1.2.1 主要实验设备

HW0301T-VBA型CO2培养箱：美国Harris公司。FACSCalibur流式细胞仪：美国BD公司。

1.2.2 主要实验试剂

荧光标记鼠抗人单克隆抗体：抗IFN-γ-FITC，抗IL-17A FITC，抗TCRγδ-PE,抗CD3 -PERCP，抗CD8-APC均为eBioscience公司产品。以上均为小鼠抗人单克隆抗体。佛波醇酯（PMA）、 钙离子霉素（Ionomycin）、莫能霉素（monesin）为Sigma公司产品。

1.3 方法

1.3.1 间日疟患者组和健康对照组细胞因子的激发和阻滞

所有样本均取1 mL全血加1 mL含10%小牛血清的RPMI1640稀释，置于48孔培养板，加入20 ng/mL佛波醇酯和500 ng/mL钙离子霉素置5%CO2培养箱刺激6 h（37℃，饱和湿度），并于刺激2 h后加入2.5 mol/L莫能霉素继续培养4 h，然后收集细胞进行细胞染色。1.3.2 流式细胞术检测分析胞内因子

流式细胞仪检测细胞因子按照常规方法进行，同时设置同型对照组。具体如下：100 μL患者和对照者压积全血（各分两管）加入PeCy5.5标记的抗CD3抗体、APC标记的抗CD8抗体和PE标记的抗TCR-γδ抗体，4℃ 避光反应20 min，加入溶血剂（BD Biosciences）室温避光溶解红细胞10 min，染色缓冲液（PBS-5%NBS-0.1% NaN3）洗两次，2%多聚甲醛4℃固定30 min，染色缓冲液洗两次，透膜缓冲液（PBS-10%NBS-0.1%皂素）4℃避光透膜15 min， 5%牛血清白蛋白和10%小鼠血清4℃避光封闭30 min，两管分别加入FITC标记的抗IL-17A抗体和FITC标记的抗IFN-γ抗体，同型对照管加抗小鼠IgG1 FITC，4℃避光反应30 min，透膜缓冲液洗两次，染色缓冲液洗一次，用2%的多聚甲醛200 μL重悬细胞，用流式细胞仪检测。应用CellQuest和WinMDI 2.8软件分析流式检测结果，非特异性吸附从同型对照中减去。

1.4 统计学分析

采用独立样本t检验分析检测结果，显著性检验标准为0.05，用SPSS13.0软件完成。

2 结果

2.1 IFN-γ在患者T细胞亚群中的表达

经分析，我们在对间日疟患者全部的外周血淋巴细胞中CD3+T细胞和CD3+CD8+T亚群的观察中没有发现分泌IFN-γ的阳性细胞比例的变化，但发现患者组CD3+CD8-T细胞中分泌IFN-γ的细胞比例（4.52±2.26%）显著高于对照组（2.71±1.04%），同时发现患者组γδ T细胞中分泌IFN-γ的细胞所占的比例（13.52±5.32%）亦显著高于对照组（7.43±4.15%），见图1、图2。

2.2 IL-17在患者T细胞亚群中的表达

图1 用流式细胞术分析一例间日疟感染患者和健康对照者外周血T细胞亚群的胞内因子Figure1 Using FACS to study the intra-cellular cytokines in T cell subsets of the peripheral blood from a PV patient and that from HD.

图2 患者组和健康对照组T细胞亚群中分泌IFN-γ的细胞比例的比较Figure2 Comparison of the proportions of cells secreteing IFN-γ in T cell subsets in PV and HD

图3 患者组和健康对照组T细胞亚群中分泌IL-17的细胞比例的比较Figure3 Comparison of the proportions of cells secreteing IL-17 in T cell subsets in PV and HD

在对全部的CD3+T细胞、CD3+CD8+T细胞和CD3+CD8-T细胞亚群的分析中没有发现分泌IL-17的阳性细胞比例的显著变化，但间日疟患者γδ T细胞中分泌IL-17的细胞所占的比例（5.88±2.13%）显著高于对照组（3.77±1.73%），见图1、图3。

本实验结果表明：急性期疟疾患者血循环中T细胞亚群表现出胞内因子分泌模式的显著变化，其中γδ T细胞分泌IL-17和IFN-γ显著增高，而在CD3+CD8-T细胞中分泌IFN-γ的阳性细胞的比例增加更为显著。

3 讨论

疟疾感染中的免疫机制研究一直受到普遍关注。以往的研究表明疟原虫感染中存在着复杂的细胞免疫机制和细胞因子效应。急性疟疾感染中作为效应细胞的T细胞亚群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12等细胞因子发挥了重要的抗感染作用。对恶性疟和鼠疟模型的研究揭示了IFN-γ在免疫保护和病理损伤中均处于中心的位置，及时而适当强度的IFN-γ响应是有效的抗原虫反应的表现[2～3]。最早的IFN-γ是由NK细胞开始分泌，随后是γδT细胞 （24～48 h），最后是αβT细胞（4～6天后）分泌。这些T细胞亚群细胞分泌的IFN-γ在生理浓度下诱导巨噬细胞活化以增强吞噬和杀伤感染红细胞[4]，但IFN-γ激活巨噬细胞产生的TNF-α、IL-1、IL-6等导致炎症级联放大效应[5]。长期的高水平炎性因子将导致机体免疫损伤和重症疟疾的发生。实验证实在恶性疟重症患者的PBMC培养上清和血浆中IFN-γ的水平远远高于无症状患者[6]。以往的IFN-γ研究多集中于Pf和鼠疟感染模型实验，直接针对p.v的细胞免疫研究较为欠缺。

IL-17是一种重要的促炎性细胞因子，相关研究报道了IL-17能够通过招募和活化中性粒细胞、促进促炎性细胞因子、趋化因子及抗体的生成以及激活T细胞等功能对细菌、真菌、病毒等病原体发挥重要的抗感染作用和免疫调节作用[7～9]。近年来的诸多证据表明IL-17在寄生虫感染免疫中同样发挥着重要作用。研究发现，给感染肺孢子虫的野生型小鼠注射抗IL-17的中和抗体后导致使感染小鼠体内的虫荷增加，表明了IL-17的保护性作用[10]；同时作为促炎性因子IL-17在炎性病理中亦扮演了重要角色。感染曼氏血吸虫继而用可溶性血吸虫卵抗原免疫的小鼠会由IL-17介导发生炎性肉芽肿，导致严重的免疫病理损伤[11]。IL-17受体缺损的小鼠对刚地弓形虫易感性提高，但同时病理损伤亦减轻，同样证明了寄生虫可通过诱导产生高水平的IL-17应答参与免疫病理过程[12]。尽管现有的证据似乎足以证实IL-17在寄生虫感染免疫过程中至关重要的保护性和炎性病理的双向效应，但IL-17在疟疾免疫中扮演的角色至今很少受到关注。

我们先前在实验中发现，间日疟患者血清中的IFN-γ和IL-17均显著高于健康对照者，提示IFN-γ和IL-17均参与了抗p.v免疫应答，但增高的细胞因子来源并不清楚。在本实验中对T细胞亚群分泌细胞因子的观察中我们发现，间日疟原虫感染者分泌IFN-γ的CD3+CD8-T细胞比例显著高于健康对照组，分泌IL-17和IFN-γ的γδT细胞比例亦显著高于对照组，部分显示了在p.v感染中细胞因子来源的特定模式。Bueno等[13]最近在对美洲间日疟感染者的研究中发现产生IL-17的CD4+T细胞在美洲间日疟急性感染病人外周血中显著增加，并与产生IFN-γ的CD4+T细胞数量密切相关，该结果提示产生IFN-γ和IL-17的T细胞亚群参与的细胞因子效应的平衡在保持适度的炎性响应和控制原虫血症的发展中具有重要意义，亦在一定程度上与我们的实验结果相为佐证。

以往的研究已经证实γδT细胞是IFN-γ的重要来源，近年来越来越多的证据表明γδT细胞也是IL-17的重要来源。Schulz等[7]发现γδT细胞通过分泌IL-17在沙门氏菌肠炎的保护性免疫中发挥效应；Peng等[14]认为结核病人中异常增多的分泌IL-17的γδT细胞参与了抗结核免疫和结核病的病理过程。本实验通过对胞内因子的检测分析初步显示了IL-17和IFN-γ在各淋巴细胞亚群表达状况，证明了在间日疟感染中作为非特异性免疫的重要组成部分的γδT细胞是IL-17和IFN-γ的重要来源，同时CD3+CD8-T细胞也是IFN-γ的重要来源。这种分泌IL-17和IFN-γ的细胞比例的增多在间日疟感染过程中是发挥协同保护性的作用抑或倾向于造成炎性病理损伤仍有待于进一步的确认；而是否能够在病程的不同阶段通过干预T细胞亚群的细胞因子分泌来有效地控制原虫血症和降低炎性病理的发生亦有待于更深入的研究。

[1] Global Health Observatory(GHO). Malaria[EB/OL].[2013-11-03]. http://www.who.intlgho/malaria/en/index.html.

[2] Luty A J, Lell B, Schmidt-Ott R, et al. Interferon-gamma responses are associated with resistance to reinfection with Plasmodium falciparum in young African children[J]. J Infect Dis, 1999, 179(4): 980-988.

[3] Su Z, Stevenson M M. Central role of endogenous gamma interferon in protective immunity against blood-stage Plasmodium chabaudi AS infection[J]. Infect Immun, 2000, 68(8): 4399-4406.

[4] Fritsche G, Larcher C, Schennach H, et al. Regulatory interactions between iron and nitric oxide metabolism for immune defense against Plasmodium falciparum infection[J]. J Infect Dis, 2001, 183(9): 1388-1394.

[5] Kern P, Hemmer C J, Van Damme J, et al. Elevated tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 serum levels as markers for complicated Plasmodium falciparum malaria[J]. Am J Med, 1989, 87(2): 139-143.

[6] Riley E M, Jakobsen P H, Allen S J, et al. Immune response to soluble exoantigens of Plasmodium falciparum may contribute to both pathogenesis and protection in clinical malaria: evidence from a longitudinal, prospective study of semi-immune African children[J]. Eur J Immunol, 1991, 21(4): 1019-1025.

[7] Schulz S M, Köhler G, Holscher C, et al. IL-17A is produced by Th17, γδT cells and other CD4-lymphocytes during infection with Salmonella enterica serovar Enteritidis and has a mild effect in bacterial clearance[J]. Int Immunol, 2008, 20(9): 1129-1238.

[8] Conti H R, Shen F, Nayyar N, et al. Th17 cells and IL-17 receptor signaling are essential for mucosal host defense against oral candidiasis[J]. J Exp Med, 2009, 206(2): 299-311.

[9] Crowe C R, Chen K, Pociask D A, et al. Critical Role of IL-17RA in immunopathology of influenza infection[J]. J Immunol, 2009, 183(8): 5301-5310.

[10] Rudner X L, Happel K I, Young E A, et al. Interleukin-23 (IL-23)-IL-17 cytokine axis in murine Pneumocystis carinii infection[J]. Infect Immun, 2007, 75(6): 3055-3061.

[11] Rutitzky L I, Lopes da Rosa J R, Stadecker M J. Severe CD4 T cell-mediated immunopathology in murine schistosomiasis is dependent on IL-12p40 and correlates with high levels of IL-17[J]. J Immunol, 2005, 175(6): 3920-3926.

[12] Kelly M N, Kolls J K, Happel K, et al. Interleukin-17/ interleukin-17 receptor-mediated signaling is important for generation of an optimal polymorphonuclear response against Toxoplasma gondii infection[J]. Infect Immun, 2005, 73(1): 617-621.

[13] Bueno L L, Morais C G, Lacerda M V, et al. Interleukin-17 producing T helper cells are increased during natural Plasmodium vivax infection[J]. Acta Trop, 2012, 123(1): 53-57.

[14] Peng M Y, Wang Z H, Yao C Y, et al. Interleukin 17-producing γδ T cells increased in patients with active pulmonary tuberculosis[J]. Cell Mol Immunol, 2008, 5(3): 203-208.

Expressions of IL-17 and IFN-γ in the T cell subset in the peripheral blood of patients infected with blood-stage plasmodium vivax

KONG Pingshi, XIA Hui
(1.The Second Tranditional Chinese Medicine Hospital of Jiangsu, Jiangsu, Nanjing 210017, China; 2.Pathogen Biology Laboratory of Bengbu Medical College, Anhui, Bengbu, 233030, China)

Objective To investigate the expressions of T cell subset which secretes IL-17 or IFN-γ in the peripheral blood of patients infected withplasmodium vivax (p.v). Methods Using FACS to detect the proportion of the cells secreteing intra-cellular cytokines IL-17 or IFN-γ of CD3+, CD3+CD8+, CD3+CD8-and γδT cells in the T cell subset of peripheral blood from patients infected withp.vand healthy donors. Results Among all of the detected T cell subsets of PV, the proportion of the CD3+CD8-T cells and γδT cells secreteing IFN-γ and the γδT cells secreteing IL-17 were higher than that of HD. Conclusion This analysis furthers people's understanding of the function of anti-p.vcellular immunity of human beings.

IL-17; IFN-γ; γδT;Plasmodium vivax

安徽省教育厅自然科学研究重点资助项目（kj2012-A-200）

1.江苏省第二中医院检验科，江苏，南京 210017 2.蚌埠医学院病原生物学教研室，安徽，蚌埠 233030

★通讯作者：夏惠，E-mail: landsky0330@163.com