pH、胃液、肠液、胆盐对强微乳酸粪肠球菌耐受性影响

包淋斌，邬向东，瞿明仁* ，刘明珠，钟启平

(1.江西农业大学 江西省高校动物营养重点实验室，江西 南昌330045;2.江西宜春强微生物科技有限公司，江西宜春336000)

当前，在养殖业和饲料工业中，由于大量使用或滥用抗生素及兽药，导致耐药性、兽药残留等问题日益突出，严重影响动物性食品的质量和安全，国家对动物饲料中添加药的控制也越来越严格。因此，研究、开发及应用无污染、无残留、无抗药性的新型微生态制剂是今后发展的重要方向［1－2］。乳酸粪肠球菌属链球菌科、肠球菌属，可与动物肠道中有益微生物群共生，具有改善动物胃肠功能，促进动物生长和提高生产性能等作用［3－6］。不同的生产厂家，由于发酵工艺、参数及载体不同，其在肠道的稳定性差别很大［7－8］。江西农业大学与宜春强微生物科技有限公司共同研制的乳酸粪肠球菌，采用了固体发酵工艺，并使用了先进的碱性营养物流加、活性颗粒载体以及促培养、包埋保护和冷藏激活等技术。为探讨强微乳酸粪肠球菌在胃肠道的稳定，本研究进行了不同pH 值、牛瘤胃液、人工胃液、人工肠液及胆盐的耐受性研究，旨在为乳酸粪肠球菌在养殖业和饲料工业中应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 乳酸粪肠球菌 由江西农业大学与宜春强微生物科技有限公司共同研制。乳酸粪肠球菌(Enterococcus faecalis)由前期研究获得，采用固体发酵工艺生产，并采用了先进的碱性营养物流加、活性颗粒载体以及促培养、包埋保护和冷藏激活等先进技术。

1.1.2 培养基 LB 培养基、HM(Mueller－Hinton)培养基购自长城生物公司。

1.1.3 胆盐、人工胃液、牛胃液、人工肠液 牛5 号胆盐购自江西省医药公司;盐酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶购自长城生物公司。牛瘤胃液，取自江西农业大学肉牛基地的楼管牛;人工肠液和人工胃液由江西农业大学动物科技学院预防兽医学实验室自行配制。人工胃液配制(pH 值为3 ～4，含胃蛋白酶1%):取胃蛋白酶1. 0 g，浓盐酸7. 0 mL，氯化钠2. 0 g，调节pH 为3 ～4。人工肠液配制:取磷酸二氢钾(KH2PO4)6.8 g，加水500 mL 使溶解，用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 值至6.8;另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1 000 mL，冰箱保存备用。

1.2 方法

1.2.1 不同pH 值处理乳酸粪肠球菌存活率测定［7－9］取10 g 乳酸粪肠球菌分别加入90 mL 生理盐水中，用1 mol/L NaOH 调整pH=2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、9.0、10.0 的，混匀于室温中分别处理30、60、90、120 min。处理后溶液用无菌生理盐水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀释，在10－5～10－6两个稀释度各取0.1 mL，加入无菌平皿;同时取未经pH 处理的乳酸粪肠球菌也做10 倍梯度稀释，取10－5～10－6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50 ℃的MH 培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37 ℃恒温培养24 h，观察并记数。以上样品均重复3 次以上，以平均数为准。

1.2.2 不同胆盐处理乳酸粪肠球菌存活率测定［7－9］取1 g 乳酸粪肠球菌分别加入0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的胆盐溶液各9 mL，混匀于室温中分别处理30 min、1、2、3 h。处理后溶液用无菌生理盐水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀释，在10 －5 ～10－6两个稀释度各取0.1mL，加入无菌平皿;同时取未经胆盐处理的乳酸粪肠球菌也做10 倍梯度稀释，取10－5～10－6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50 ℃的MH 培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37 ℃恒温培养24 h，观察并记数。以上样品均重复2次以上，以平均数为准。

1.2.3 人工胃液、牛胃液处理乳酸粪肠球菌存活率测定［7－9］取1 g 乳酸粪肠球菌分别加入人工胃液、牛胃液各9 mL，混匀于室温中分别处理于1、2、3、4、5 h。处理后溶液用无菌生理盐水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀释，在10－5～10－6两个稀释度各取0.1 mL，加入无菌平皿;同时取未经胃液处理的乳酸粪肠球菌也做10 倍梯度稀释，取10－5～10－6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50 ℃的MH 培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37 ℃恒温培养24 h，观察并记数。以上样品均重复2 次以上，以平均数为准。

1.2.4 肠液处理乳酸粪肠球菌存活率测定［7－9］取1 g 乳酸粪肠球菌加入肠液各9 mL，混匀于室温中分别处理于2、4、6、8、10 h。处理后溶液用无菌生理盐水做10－1、10－2、10－3……10 倍梯度稀释，在10－5～10－6两个稀释度各取0.1 mL，加入无菌平皿;同时取未经肠液处理的乳酸粪肠球菌也做10 倍梯度稀释，取10－5～10－6两个稀释度为对照。将溶化后冷却至50 ℃的MH 培养基迅速倾注平皿，小心混匀。置37 ℃恒温培养24 h，观察并记数。以上样品均重复2 次以上，以平均数为准。

1.2.5 存活率计算 乳酸粪肠球菌存活率=处理后活菌数/未处理活菌数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同pH 值处理乳酸粪肠球菌存活率

从表1 可见，随着处理时间的延长，在任何pH 值条件下，乳酸粪肠球菌的存活率都明显降低。处理30 min 时，以pH 10 最低，以pH=2，9 较高，处理120 min 时，仍是pH =10 时存活率低，以pH =3，8较高。总体来看，乳酸粪肠球菌在酸性条件下存活率较高，在强碱(pH=10)条件下耐受性较差。

表1 不同pH 值处理乳酸粪肠球菌存活率Tab.1 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with different pH %

2.2 不同胆盐处理乳酸粪肠球菌存活率

从表2 可见，乳酸粪肠球菌在胆盐处理后，随时间延长，存活率均呈下降，在30 min 内，存活均比较高;在1 ～2 h 存活率仍然比较高，但处理3 h 后，4 个不同的胆盐浓度下，存活率明显下降;而不同浓度来看，随着胆盐浓度上升，存活率越低的规律。0.2% ～0.4%浓度的胆盐处理乳酸粪肠球菌，对其存活率影响不大，但高浓度(0.5%)胆盐处理后，对其存活率影响较大。

表2 不同浓度胆盐处理乳酸粪肠球菌存活率Tab.2 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with different concentration of bile salt %

2.3 天然牛瘤胃液、人工胃液处理乳酸粪肠球菌存活率

从表3 可见，乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，处理3 h，存活仍有95%以上。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理1 h，存活率就下降到81%;2 h，存活率就仅有61%左右;3 h 后，又有近一半死亡，存活率仅37.93%;4 h 后，存活率不到30%。

2.4 人工肠液处理乳酸粪肠球菌存活率

从表4 可见，乳酸粪肠球菌对人工肠液有一定的耐受性。在2 h 内，存活率达98.16%;4 h 存活率仍有72.64%。但4 h 后，存活率明显下降，8 h 降至40%以下，10 h 后，则降至30%以下。

表3 人工胃液、牛瘤胃液处理乳酸粪肠球菌存活率Tab.3 The survival rate of Streptococcus faecalis deal with artificial gastric juice and ruminal fluid %

表4 人工肠液处理乳酸粪肠球菌活菌含量和存活率Tab.4 The survival rate and lactobacillus content of Streptococcus faecalis deal with artificial intestinal juice %

3 讨论与结论

3.1 乳酸粪肠球菌对pH 值耐受性

通常胃酸pH 值在3.0 左右，流体食物在胃中停留的时间为1 ～2 h，进食后很短时间内，胃内pH 值可以上升到6.0 左右［10－11］。Kos 等［12］］认为，益生菌通过胃肠道时，食糜作为一种保护剂使益生菌受到伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠中能存活下来，随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。益生菌如能够耐胃酸低pH 环境，顺利通过胃到达肠道，为发挥益生菌作用提供了先决条件。闫培芳等［13］比较不同碱性条件对生物膜状态粪肠球菌的影响，结果表明:生物膜状态粪肠球菌对碱性环境具有强的耐受性，pH 值为7 ～9 时，对生物膜状态粪肠球菌无明显影响。本研究表明:乳酸粪肠球菌以pH=2，9 时存活率较高，以pH =10 最低，表明:强微乳酸粪肠球菌对酸性受性更强，对碱性尤其是强碱(pH=10)耐受性较差。与闫培芳等［13］结果不一致，原因是其使用的乳酸粪肠球菌没有经过包被处理，而本试验采用的强微乳酸粪肠球菌是经过包被处理的，因此其抵御酸的能力增强。

3.2 乳酸粪肠球菌对胆汁、胃液和肠液耐受性

对胆汁、胃液和肠液的敏感性也是筛选益生菌的重要指标。对胆盐、胃液和肠液的耐受是细菌的在宿主肠道中定殖和代谢的前提条件［14］。许光胜等［15］报道，从健康猪直肠内容物中分离到NA14 菌株具有较强的耐受人工胃液和耐胆汁的能力。本研究结果表明:0.2% ～0.4%浓度的胆盐处理乳酸粪肠球菌，对其存活率影响不大，但高浓度(0.5%)胆盐处理后，对其存活率影响较大。乳酸粪肠球菌对天然牛瘤胃液耐受性比较强，处理3 h，存活仍有95%以上。而对人工胃液的耐受性明显下降，经人工胃液处理3 h 后，存活率仅37.93%。4 乳酸粪肠球菌对人工肠液的耐受性在2 ～4 h 内比较强，存活率仍然达到72.64%。与上述报道相似。

强微乳酸粪肠球菌能耐受较低的pH，对胃液、肠液、胆盐耐受性较高，故在胃肠道中较稳定。

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