通草提取工艺及其鉴别的研究

★ 刘靖岩 贾艾玲 邱智东 (长春中医药大学 长春 130117)

通草提取工艺及其鉴别的研究

★ 刘靖岩*贾艾玲**邱智东 (长春中医药大学 长春 130117)

目的：对通草提取工艺及薄层鉴别进行研究。方法：采用L9(34)正交设计安排实验,用薄层色谱(TLC)进行定性鉴别,用紫外分光光度法(UV)进行含量测定。结果：优选了通草的最佳提取工艺，在薄层色谱中可检出特征斑点。结论：该提取工艺和质量控制方法科学合理,可作为通草生产和质量控制的依据。

通草；提取工艺；薄层鉴别

通草为五加科植物通脱木Tetrapanaxpapyrifer(Hook)K.Koch的干燥茎髓。主要分布在西南及陕西、江苏、安徽、浙江、江西、福建、台湾、湖北、湖南、广东、广西等地，主产于台湾、贵州、广两、云南。具有清热利尿、通气下乳等功效，用于湿温尿赤、淋病涩痛、水肿尿少、乳汁不下。2010版《中国药典》中对通草仅有性状和显微鉴别,缺少对其有效成分的鉴别和含量要求,而目前市售通草品种混乱,掺次掺伪日益增多。鉴于通草中多糖含量较高,本实验对此作出相关研究,对通草中多糖进行含量测定并对其薄层进行定性鉴别,为完善其质量评价体系奠定基础。

1 仪器与试剂

紫外分光光度计(仪器型号:TU-1810PC)，葡萄糖对照品(由中国药品生物制品检定所提供，批号：110833—200904)，5%苯酚，硫酸溶液，购自北京化工厂，所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 正交试验设计 根据预试验结果,以总多糖含量和出膏率为考察指标,以加水量、煎煮次数、提取时间作为3个考察因素,优化提取工艺，因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.2 总多糖含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

取葡萄糖对照品适量，精密称定，加蒸馏水制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取水煎干膏适量，研细，过60目筛，精密称定约0.2g，置于100mL锥形瓶中，加入蒸馏水50mL，密塞，称定重量，超声处理15分钟，放冷，再称定重量，用蒸馏水补足减失的重量，摇匀，滤过，收集续滤液。吸取1mL续滤液置于10mL容量瓶中，加蒸馏水至刻度，再用0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液(99.8μg/mL)0.1，0.2,0.4,0.6，0.8,1.0mL,分别置于10mL具塞试管中，加蒸馏水至1.0mL，加入1mL5%苯酚溶液，摇匀后，迅速加入5mL浓硫酸溶液，混匀，于100℃沸水浴中，加热15分钟后取出，放入冰浴中，冷却15分钟。在490nm处测定吸光度。以浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标求得回归方程：Y=0.00613X-0.05364，r=0.9999，结果表明，葡萄糖在9.98μg/mL～99.8μg/mL浓度范围内，与吸收度呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验

精密吸取对照品溶液0.6mL，置于10mL具塞刻度试管中，加入蒸馏水至1mL，按“2.2.3”项下的方法显色，测定吸光度，重复6次。结果表明该方法的精密度良好,RSD为0.55%(n=6)。

2.2.5 稳定性试验

精密吸取供试品溶液,按“2.2.3”项下的方法显色,分别于0,10,20,30,40,50分钟不同时间测定其吸光度,供试品RSD为0.15%，说明供试品在50分钟内稳定性较好，测定结果准确、可靠。

2.2.6 重现性试验

精密称取正交样品中2号样6份，每份0.2g按照供试品溶液项下的方法制备，精密吸取0.5mL供试品溶液置于具塞试管中，加蒸馏水至2.0mL。按“2.2.3”项下的方法显色,测定吸光度，并计算总多糖平均含量为850.0764mg/g，RSD=2.52%，说明重现性较好。

2.2.7 加样回收率试验

取已知含量供试品粉末(总多糖850.0764mg/g)6份,每份约0.1g,分别加入等量的葡萄糖对照品粉末,按“2.2.3”项下的方法显色,测量吸光度值,并计算含量及加样回收率,结果见表2。

表2 回收率试验结果

结果表明，平均回收率为100.47%，RSD=2.12%。本法回收率较好，方法可行。

2.3 通草的提取制备最佳工艺确定：正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 正交试验结果

表4 方差分析结果表

由以上极差分析及方差分析可知，影响因素大小顺序为：Cgt;Agt;B，即煎煮次数C是主要影响因素，加水量A是次要影响因素，而煎煮时间B对试验结果影响较小。各因素的最佳水平依次为：A因素的第1水平，B因素的第1水平，C因素的第3水平，确定A1B1C3为最佳提取方案，即加30倍量水，提取3次，每次1小时。

2.4 通草的定性鉴别

取本品粉末3g,加60%甲醇30mL,于水浴上加热回流1小时,滤过,滤液蒸干,残渣加甲醇10mL溶解,滤过,滤液浓缩至约1mL,作为供试品溶液。另取通草对照药材3g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯(7∶3)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；喷以香草醛硫酸试液，在105℃加热至斑点显色清晰，显相同颜色的斑点。

3 讨论

3.1 以出膏率、总多糖转移率为考察指标,通过综合评分,由表4中极值F值大小显示,各个因素作用主次为C﹥A﹥B,由表3方差分析结果表明,A因素无显著性意义(P﹥0.05),B因素也无显著性意义(P﹥0.05),C因素有显著性意义(P﹤0.05),以A1B1C3为最佳,即以加30倍量水、煎煮提取3次、每次1小时为最佳提取工艺。

3.2 本实验在目前国内对通草药材化学成分研究较少的背景下采用TLC对其有效成分进行鉴别,方法简便、易行,结果清晰,对仪器设备要求较低。由于《中国药典》2010版一部通草项下并未收录通草的薄层鉴别方法,通过条件摸索,初步定为展开剂∶石油醚—乙酸乙酯(8∶2)，展开时，对照药材与供试品斑点Rf值均较低,把比例调整为石油醚—乙酸乙酯(7∶3)时,则效果较好,斑点清晰;重现性好。

3.3 本实验对通草提取制备工艺进行了研究,以主要有效成为指标,设计优选了通草有效成分的最佳制备工艺;运用UV、TLC等方法对通草进行了化学表征和鉴别研究,初步建立了通草的质量标准,可作为通草生产和质量控制的依据。今后还将对通草进行多指标检测,尽量阐明通草中的各种有效成分，进一步完善通草的质量标准。

刘靖岩，硕士研究生，中药制剂研究方向，Tel：15164310437，E-mail：438831128@qq.com

**通讯作者:贾艾玲,硕士,助教,从事中药制剂的研究,Tel:18684341320，E-mail:171265932@qq.com

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2013-07-22)