重组水蛭素对UUO大鼠肾间质纤维化影响及机制研究

★ 何敏 徐再春 潘庆 李娜 (.浙江省立同德医院 杭州 300；.浙江中医药大学 杭州 30053)

重组水蛭素对UUO大鼠肾间质纤维化影响及机制研究

★ 何敏1*徐再春**潘庆1李娜2(1.浙江省立同德医院 杭州 310012；2.浙江中医药大学 杭州 310053)

目的：探讨重组水蛭素(recombinant hirudin，rH)对单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠对肾间质纤维化(RIF)的作用及其可能机制研究。方法：将48只SD大鼠随机分为假手术组(N组)、模型组(M组)、依那普利治疗组(Y组)和重组水蛭素组(R组)，后3组建立UUO大鼠模型。治疗结束后处死大鼠，测大鼠肾功能，行HE、Masson染色观察肾间质病理变化，用免疫组化半定量法测定肾TGF-β1、α-SMA的表达。结果：两治疗组大鼠BUN、SCr低于模型组(Plt;0.01)，两治疗组组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)；免疫组化结果表明，两治疗组TGF-β1和α-SMA的表达量均低于模型组(Plt;0.01)，两治疗组组间差异无统计学意义(Pgt;0.05)。结论：重组水蛭素可能通过下调TGF-β1和α-SMA，减少促纤维化生长因子及肌成纤维细胞的增殖、活化、表型转化从而起到防治RIF。

重组水蛭素；肾间质纤维化；转化生长因子β1；α-平滑肌肌动蛋白

肾脏纤维化是各种肾脏疾病慢性进展到终末期肾衰竭的共同途径[3]，其中各种炎细胞的浸润，一系列细胞因子的作用，细胞外基质(ECM)产生与降解的失衡等均参与了肾间质纤维化的发生与发展[4]。TGF-β1迄今为止已知作用最强的促纤维化细胞因子，α-SMA是肌成纤维细胞的标志物。本实验观察重组水蛭素对UUO大鼠模型中TGF-β1、α-SMA的表达水平的影响，探讨重组水蛭素对UUO大鼠RIF的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

健康成年雄性SD大鼠48只，体重190～210g。由浙江省中医药研究院实验动物中心提供。

1.1.2 实验药物

注射用重组水蛭素购于大连保税区联合博泰生物技术有限公司，规格：比活≥12 000 ATU/mg，纯度≥95%，批号：20111013；马来酸依那普利片剂(江苏扬子江制药有限公司生产，批号：11031701)。治疗药物均放入4℃冰箱保存备用，使用时摇匀。

1.1.3 实验试剂

民间融资监管法律以正当利益为平衡点促进双方行为选择的动机理性。融资权利作为私权利，法律设置主体行为界限是不损害他人的自由权利，凡不危及他人利益的行为皆可认为是动机理性。监管者是社会公共利益代表，法律设定其保护融资权利实现的职责以对权力行使进行目的性限制。当融资主体行为不伤害他人正当利益时，监管者不必也不得行动。因为权力行使是防止双方互相侵害而非直接实现，只要融资主体不伤害他人正当利益就必须尊重其行为选择的自由。此时，即使可能更有利于对方利益实现，权力也不可行使。只有当融资主体行为伤害他人利益时，监管者才能对之进行限制和处罚。

BUN试剂盒、SCr试剂盒、HE染色试剂盒、Masson染色试剂盒、兔抗大鼠α-SMA多克隆抗体、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体、生物素化羊抗鼠IgG：北京博奥森生物工程有限公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及造模方法

48只大鼠适应性饲养1周后按体重随机分为假手术组(N组)、模型组(M组)、重组水蛭素组(R组)及依那普利组(Y组)，每组12只。造模方法：所有大鼠均采用质量浓度为10%水合氯醛(30mg/100g体重)腹腔注射麻醉。取仰卧位固定于手术台上，碘酒及75%酒精消毒手术区，铺无菌洞巾，沿腹白线钝性分离皮下组织、肌层直至腹腔，游离左侧肾脏及输尿管，用组织钳分离后托起左侧侧输尿管中段部位，用4-0丝线结扎左侧输尿管上下两端，上一道结扎点位于左肾下级水平，然后剪断两结扎点之间输尿管，检查手术视野有无持续出血，然后逐层缝合皮下组织及皮肤，清洁伤口,并用灭菌辅料包扎，喂水并观察，术后1天即拆下辅料。假手术组手术方式对输尿管中段仅做分离，但不结扎及剪断输尿管，余操作同UUO。

1.2.2 干预方式

术后1天开始干预，R组：重组水蛭素1.5mg/kg·天皮下注射；Y组：依那普利10mg/kg·天灌胃；N组、M组：给予等量生理盐水皮下注射；疗程 4周。

1.2.3 观察指标及操作方法

给药结束后，采血测肾功能，留取梗阻肾脏，行HE、Masson染色、TGF-β1及α-SMA免疫组化染色检测。采用Image-ProPlus5.0图像系统进行分析，每张切片随机选取切片400倍镜下选取5个不重叠视野对肾组织的病变情况进行积分光密度值(IOD值)分析，采用平均IOD值作为该例大鼠TGF-β1、α-SMA的相对表达量。

1.2.4 统计学方法

2 结果

2.1 肾功能比较

见表1。

表1 各组大鼠治疗后BUN、SCr的比较

1.模型组(HE染色×100)；2.重组水蛭素组(HE染色×100)；3.模型组(Masson染色×400)；

2.2 肾脏组织病理观察

HE染色示：模型组见肾实质变薄，皮髓分界不清，伴有肾小管上皮细胞肿胀、弥漫性空泡变形，远端小管上皮细胞扁平、间质增宽，部分肾小管管腔内有蛋白管型；肾间质内大量炎性细胞浸润、肌成纤维细胞增生，间质纤维化，肾小球病变改变不明显(见图1)；重组水蛭素组及依那普利组：病变较模型组轻，肾小管扩张、炎细胞浸润、细胞外基质较模型组减少(见图2)。

Masson示：模型组可见肾间质皮髓交界处有大量蓝色胶原纤维增生，肾小球无明显病变(见图3)，重组水蛭素组和依那普利组肾间质胶原纤维较模型组减少(见图4)。

2.3 TGF-β1、α-SMA的表达情况

TGF-β1在假手术组间质区仅有微量表达，在模型组肾小管间质区可见较多片状或线样分布于肾小管上皮细胞、间质细胞中(见图5-7)。α-SMA除去在血管平滑肌上表达的部分，在间质区的表达部位与TGF-β1相似(见图8-11)。

各组大鼠α-SMA及TGF-β1的表达比较见表2。

表2 各组大鼠α-SMA 及TGF-β1的表达比较

3 讨论

TGF-β是一种调节细胞生长和分化的超家族分子，其中以TGF-β1最为重要，它是迄今为止已知作用最强的促纤维化细胞因子。TGF-β1通过多个环节参与肾间质纤维化，导致ECM过度积聚，此生物作用已被多种实验证实[5]。α-SMA是平滑肌和肌成纤维细胞的标志蛋白，其在肾脏胚胎发育期曾被发现，但在正常成熟的肾脏除了肾血管平滑肌细胞外，肾脏的实质及间质细胞均无表达或痕量表达α-SMA。在慢性肾纤维化过程中，间充质细胞表型转化表达α-SMA是其活化及损伤的标志，且是核心环节。

水蛭，其药性较为平和，是一味“活血不伤正”的活血要药，临床上常用于慢性肾脏疾病的长期治疗，其能够改善肾功能，降低蛋白尿，降低血脂，具有抗血栓，抗凝，改善血液流变性，抗炎、抗增殖等多种药理活性[1]。重组水蛭素作为水蛭最主要的活性成分经过基因重组技术研制的产物，其运用于肾脏疾病的实验及临床研究较少。本研究发现重组水蛭素组大鼠肾功能、梗阻肾肾脏病理、免疫组化α-SMA 及TGF-β1的相对表达量等指标明显优于模型组，揭示了重组水蛭素可减轻肾功能损害，减轻UUO大鼠肾脏病理结构变化，保护残余肾功能，有效地延缓肾间质纤维化的进展。其机制可能与下调TGF-β1和α-SMA表达，减少促纤维化细胞因子生成，抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的表型转化，使细胞外基质胶原(ECM)生成减少有关。

目前国内外重组水蛭素主要用于肾脏病的血液透析抗凝治疗领域[6]，对于肾脏疾病本身的研究较少。但我们相信随着大量实验及临床研究的深入，重组水蛭素在慢性肾脏病中的应用前景将更加广阔。

[1]危成筠.水蛭及水蛭素在肾脏病中的应用及研究进展.中国中医药科技,2001,08(2): 136-137.

[2]王金海,冯长青.活血化瘀应贯穿于肾脏病治疗之始终.甘肃中医学院学报,2005,22(6): 15-17.

[3]Buhl R, Stephen G. Future directions in the pharmacologic therapy of chronic obstructive pulmonary disease[J]. ATS, 2005, 2 (11):83-93.

[4]谷海瑛,赵宗江,杨美娟.复方鳖甲软肝片对单侧输尿管结扎大鼠肾组织NF-κB表达的影响.中国中西医结合肾病杂质,2005,06(3):137-139.

[5]El Chaar M, Chen J, Seshan S V, et al. Effect of combination therapy with Enalapril and the TGF-beta antagonist1D11 in unilateral ureteral obstruction. Am J Physiol Renal Physiol, 2007,292 ( 4 ): F1 291-1 301.

[6]Vanlholder RC,Camez AA,VeysNM,et a1.Recombinant hirudin:especific thombin inhibiting anticoagulant for helnodiaiysis[J].Kindey intematlbnal,1994,45:1 754-1 759.

征稿启事

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何敏(1987-)，女，汉族，浙江衢州人，硕士研究生，研究方向：中西医结合临床(肾脏病学)。

**通讯作者：徐再春，男，汉族，浙江杭州人，教授，主任中医师，博士研究生导师，研究方向：肾脏病的中西医结合临床与实验研究，Tel：18989848828，E-mail：429491507@qq.com

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2013-05-30)