APP下载

ICC和Cx43参与半夏泻心汤治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制*

2013-11-04张燕刘换新梁敏燕张宏袁怀文刘梅叶春邢德刚武警广东总队医院病理科广州50507广东药学院生理学教研室广州50006

江西中医药 2013年10期
关键词:胃轻瘫胃窦豚鼠

★ 张燕 刘换新 梁敏燕 张宏 袁怀文 刘梅 叶春 邢德刚 (.武警广东总队医院病理科 广州 50507;.广东药学院生理学教研室 广州 50006)

ICC和Cx43参与半夏泻心汤治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制*

★ 张燕1**刘换新1梁敏燕1张宏1袁怀文1刘梅1叶春1邢德刚2(1.武警广东总队医院病理科 广州 510507;2.广东药学院生理学教研室 广州 510006)

目的:探讨ICC(interstitial cells of Cajal)和Cx43(Connexin43)在半夏泻心汤治疗豚鼠糖尿病胃轻瘫的过程中所起的作用及其机制。方法:制备半夏泻心汤含药血清并建立糖尿病胃轻瘫豚鼠模型。处死豚鼠并取材胃标本后免疫组化染色标记c-Kit和Cx43抗体,显微镜下观察并比较实验各组豚鼠ICC和Cx43的数量及变化,并通过电子显微镜观察ICC的超微结构变化。结果: 半夏泻心汤含药血清能明显增加糖尿病胃轻瘫豚鼠ICC数量,并能修复其受损的超微结构。结论:ICC的数量显著减少并发生变性是发生糖尿病胃轻瘫的一个重要原因,半夏泻心汤含药血清能明显增加豚鼠ICC的数量并修复其受损结构,进而增强实验豚鼠的胃动力并恢复其功能,从而起到治疗糖尿病胃轻瘫的作用。

半夏泻心汤;糖尿病胃轻瘫;免疫组化;ICC;Cx43

糖尿病胃轻瘫(diabetic gastroparesis syndrome,DGP)由Kassander于1958年首次提出这个概念,DGP的发病率大约有30%-50%,是糖尿病(DM)一个常见而重要的并发症[1],它不但引起消化道症状导致营养不良和水电解质紊乱,还可削弱血糖的调控,改变口服药物的吸收,促进糖尿病慢性并发症的发生和发展,严重影响患者的生活质量。实验研究表明其无论对在体胃肠运动还是离体胃肠运动均具有双向性调节作用[2]。以往的临床应用表明,半夏泻心汤被广泛运用于治疗消化道运动障碍性疾病, 尤其是在治疗胃肠功能性消化不良、糖尿病胃轻瘫方面疗效卓著[3,4]。本课题实验采用免疫组化标记c-Kit和Cx43以及透射电镜观察ICC的超微结构变化,观察半夏泻心汤对大鼠胃平滑肌的影响,并探讨ICC和Cx43在半夏泻心汤治疗豚鼠糖尿病胃轻瘫的过程中所起的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年EWG/B型豚鼠160只(广东省医学实验动物中心提供),体重250-350g之间,雌雄不限。

1.2 制备含药血清

实验用中药材购自广州市二天堂大药房,给药剂量依照人单位药方水煎剂的生药剂量比例按原著根据文献折算(半夏泻心汤组方由半夏55.78g、黄芩、干姜、人参、炙甘草各46.875g、黄连15.625g、大枣42g组成,依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量,扩大10倍)。于煎煮容器内,加相当于药材量5倍的冷水浸泡1小时,煮沸30分钟,再加3倍量水继续煎煮20分钟,煎煮液浓缩后,制成浓缩液。按照剂量,每日分上、下午2次给药。第3日全量给药后颈总动脉取血,立即注入无菌管中,室温静置,待血液凝固,血清析出后,吸取上清离心,再吸取上清即为含药血清。灭活30分钟,用微孔滤膜过滤除菌,经培养实验证实无微生物污染后,置于-20℃保存备用。

1.3 建立糖尿病胃轻瘫模型

将豚鼠随机分为2组,糖尿病组120只,正常对照组40只。糖尿病组豚鼠给予2%链脲佐菌素溶液80mg/Kg,腹腔注射,1周后测尿糖、血糖。尿糖(+++)以上,血糖浓度≥11.1mmol/L,确定为糖尿病模型,不符合要求的豚鼠予以剔除。正常对照组给予腹腔注射等量的生理盐水,血、尿糖正常。两月后通过记录色素胃排空和肠道传输速度,确定糖尿病胃轻瘫模型成功建立。

1.4 实验动物分组及给药方法

从糖尿病胃轻瘫模型组豚鼠中挑选出80只,随机分成2组,其中半夏泻心汤给药组40只,模型组40只,另设空白对照组40只。自糖尿病胃轻瘫模型造模成功后第8天起半夏泻心汤组豚鼠每日2次给予半夏泻心汤药液灌胃,每次给药1mL/100g体重,连续服药14天;空白对照组自由饮用水;模型组每日灌服生理盐水2mg/100g体重,连续服用14天。

1.5 实验方法

实验前动物禁食24小时,饮水不限。实验时猛击大鼠头部致昏,迅速取材其全胃标本,沿胃小弯剪开胃,切成2×1.5×0.3cm3大小的组织块,10%福尔马林液固定,常规组织脱水、石蜡包埋、石蜡切片、HE染色、中性树脂封片,光学显微镜下观察并比较对照组和实验组用药后胃平滑肌细胞的病理形态改变。通过采用免疫组化标记c-Kit和Cx43,透射电镜观察ICC的超微结构等多种分子病理学技术,比较半夏泻心汤含药血清用药后糖尿病胃轻瘫动物模型胃平滑肌细胞、Cajal间质细胞和Connexin43的变化,从而探讨其治疗作用及机制。具体方法如下:(1)免疫组织化学检测:使用即用型免疫组织化学超敏S-P试剂盒,采用ABC法染色。常规切取4μm切片,脱蜡至水,经H2O2阻断和抗原修复后严格按照试剂说明书进行操作,特异性标记c-Kit和Cx43,观察用药后胃Cajal间质细胞和Connexin43的变化。(2)采用透射电子显微镜观察ICC超微结构的变化:包括ICC细胞之间、及与其他细胞之间的连接结构、线粒体和细胞器的变化,染色质及肌膜的改变等。

1.6 免疫组织化学检测胃窦组织中ICC和Cx43的数量和表达

采用免疫组织化学 SP二步法测定。SP免疫组织化学试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司,试剂采用兔抗人c-Kit (Anti-Human CDll7)和Cx43单克降抗休。取10%中性甲醛溶液固定后的胃窦组织,脱水、透明、石蜡包埋、切片,染色方法按SP试剂盒说明书写的步骤进行。每批染色均设立阳性对照及阴性对照,用已知阳性组织切片作为阳性对照,以磷酸盐缓冲液(PBS)替代一抗作为阴性对照。光学显微镜下计数染色阳性细胞,每张切片随机各取6个视野,通过HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行计算机读片和测量分析,c-Kit和 Cx43均以细胞膜和细胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。

1.7 制作电镜标本并观察ICC超微结构

将大鼠胃体组织剪切成1mm3小块若干,置于2.5%戊二醛固定,0.1mol/L磷酸缓冲液(PBS)漂洗3次,1%四氧化锇固定l小时。再用0.1mol/L的磷酸缓冲液PBS漂洗3次,乙醇、丙酮梯度脱水。环氧树脂(Epon)812包埋,聚合37℃24小时,48℃24小时,60℃48小时。超薄切片机切片,厚约60-70nm,200目铜网捞片,酒精醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重电子染色,在日立H-600型透射电镜下观察,照相。每例标本观察20个以上铜网,观察Cajal间质细胞、平滑肌细胞、神经和血管并随机摄片。

2 结果

2.1 一般情况

造模2个月后,糖尿病组大鼠血糖明显升高,出现了明显多饮、多尿、多食,大便性状改变,大便干稀不等,精神倦怠,反应迟钝,体态瘦小,皮毛稀疏无光泽,皮肤溃疡明显高于对照组;糖尿病组大鼠的平均体重 (203.4±39.2)g,明显低于正常对照组大鼠(386.8±44.5)g;糖尿病组大鼠的血糖为(25.3±2.8)mmol/L,明显高于正常对照组(4.6±0.6)mmol/L;糖尿病组大鼠的胃排空率为(62.6±4.7)%,显著延迟于正常对照组(81.4±7.2)%,由此确定糖尿病胃轻瘫模型建立成功。

2.2 胃ICC和Cx43的免疫组化表达情况

ICC的阳性表达情况。

2.2.1 正常对照组

c-Kit阳性细胞呈棕黄色颗粒,定位于细胞膜和细胞质,密集地分布在胃体和胃窦部环形肌层和纵形肌层之间,主要集中于环形肌层内及附近,肌间神经丛之间和黏膜下内环肌层表面也有密集的ICC分布,胃底肌间神经丛未见ICC分布(图1)。

2.2.2 糖尿病胃轻瘫模型组

c-Kit阳性细胞分布密度明显弱于对照组,非常稀疏地分布在环形、纵形肌层间,而且无环形肌层内及附近主要分布的特点(图2)。

2.2.3 半夏泻心汤治疗组

阳性细胞同正常对照组一样主要分布在胃体和胃窦部环形肌层内及附近,数量较多(图3)。

2.2.4 Cx 43的阳性表达情况

对照组和半夏泻心汤治疗组Cx 43阳性表达密集分布在胃体和胃窦部环形肌层中,阳性表达的强弱与ICC的阳性分布具有一致性;糖尿病胃轻瘫模型组 Cx43的表达明显低于正常对照组。

2.3 胃ICC超微结构的变化

电镜观察结果显示。

2.3.1 正常对照组

大鼠胃ICC主要分布于胃窦环形肌与纵形肌之间的肌问神经丛周围,由许多缝隙连接紧密地连接在一起,ICC之间及其与平滑肌细胞、神经细胞之间多见由紧密并置的质膜形成的缝隙连接,细胞超微结构改变不明显(图4)。

2.3.2 糖尿病胃轻瘫模型组

胃窦ICC与其它的ICC、平滑肌和神经末梢之间的缝隙连接均显著减少,尚存的细胞问连接的结构也有破坏,结构不清,连接松散且问隙增大;ICC细胞内细胞器数量明显少于正常对照组;ICC细胞的基膜结构不完整,缺乏连续性,有的基膜与细胞膜分离,形成空洞;ICC细胞内的胞质广泛溶解,有大量的胞质内空泡形成,空泡大多沿质膜分布;线粒体肿胀、空泡样变、甚至溶解,内质网也有扩张(图5)。

2.3.3 半夏泻心汤治疗组

可见胃窦ICC与平滑肌和神经末梢之间的缝隙连接均明显增多,有较发达的滑面内质网、线粒体和高尔基体,偶见基底膜不完整、线粒体轻度肿胀;胃ICC的数量较胃轻瘫模型组增多,较正常对照组稍减少。ICC形态结构基本正常,细胞表面突起增多,可见细胞连接,胞质内线粒体数量较胃轻瘫模型组增多,嵴清晰可见,粗面内质网排列整齐,数量较多,表面核糖体颗粒均匀。大鼠胃窦部lCC的数量较模型组为多。胃ICC之间、ICC与平滑肌细胞及神经末梢间连接的病理损害较胃轻瘫模型组轻,其结构较清晰而紧密。壁内神经及Icc的分布及突起连接的病理损害较胃轻瘫模型组为轻 (图6) 。

3 讨论

糖尿病胃轻瘫(DGP)是近年来研究的一个热点,目前认为它是一个多因素疾病,其具体病理生理机制尚不十分清楚。因此,研究中医药治疗糖DGP的作用机制能为胃动力障碍疾病的防治提供理论依据,具有重要临床意义。消化道通过胃肠道平滑肌细胞的舒缩运动来完成对食物的机械性消化,并推动食物的前进。平滑肌细胞是胃肠道运动的基本结构和功能单位,在80年代末,Bitar和Makhfou首先建立了测量豚鼠分离胃平滑肌细胞技术,许文燮等将其技术做出相应调整,成功制备了豚鼠游离单个胃平滑肌细胞,并应用于实验研究[5]。胃肠道Cajal间质细胞((interstitial cells of Cajal,ICC)是一类具有独特功能的间质细胞,由西班牙神经解剖学家 Cajal于1893年首次发现,这些细胞呈网状分布在胃肠道神经末梢与平滑肌细胞之间,对控制胃肠动力功能起关键作用。ICC是胃肠慢波的起搏细胞,主要参与胃肠基本电节律(BER)调控和神经递质信号转导,近年来进行的一系列研究表明这种细胞在胃肠电及动力发生和运动障碍机制中有重要作用[6],研究证实ICC数量减少或网络结构破坏可造成胃慢波消失或节律失常,胃排空延迟[7]。Jameson等[8-10]发现糖尿病患者胃活体组织切片显示ICC明显减少,甚至缺失。ICC表达原癌基因c-kit,cKit表达一种受体酪氨酸激酶-CD117/c-Kit蛋白,它是干细胞因子(stem cell facter,SCF)受体,可被特异性的抗体检测出来[11,12]。应用针对c-kit的免疫组化标记抗体可以特异性识别ICC[13],在显微镜下观察ICC的分布和密度。

ICC网络与平滑肌细胞间通过缝隙连接(gap junctions)相连,其发挥生理功能的重要结构基础,Connexin43(Cx43)是最重要的缝隙连接蛋白。实验证实糖尿病胃轻瘫大鼠胃壁内Cajal间质细胞明显减少,Cx43表达也明显减低。张亚萍等用透射电镜发现糖尿病大鼠ICC与其他细胞间的连接结构显著破坏,线粒体肿胀,空泡样变,细胞器数量减少,异染色质明显,肌膜分离形成空洞,ICC超微结构的改变造成其功能改变,这可能是糖尿病胃肠功能紊乱的病因之一[14-16]。本研究通过多种分子病理学技术方法,采用免疫组化标记c-kit和Cx43,透射电镜观察ICC的超微结构等,比较半夏泻心汤含药血清治疗前后糖尿病胃轻瘫动物模型胃平滑肌细胞、ICC和Cx43的变化,从而探讨其治疗作用及机制。这不仅能从细胞和分子水平探讨半夏泻心汤治疗糠尿病胃轻瘫的作用机制,也能为临床防治胃肠运动障碍性疾病提供重要的理论依据。

综上,本实验研究通过采用免疫组化染色标记c-Kit和Cx43抗体观察实验豚鼠ICC和Cx43的数量和变化,以及采用透射电子显微镜观察豚鼠ICC的超微结构变化,从分子生物学角度基本阐明了半夏泻心汤含药血清治疗糖尿病胃轻瘫的作用机制,即半夏泻心汤含药血清能明显增加大鼠ICC的数量并修复其受损结构,进而增强实验豚鼠的胃动力并恢复其功能,从而起到治疗糖尿病胃轻瘫的作用,由此能成为中药现代化研究的一个新的突破口。

[1]季建隆,赵云燕.糖尿病胃轻瘫中西医研究进展[J].中华现代中医学杂志.2008,4(4):322-325.

[2]邢德刚,魏凤香,梁燕玲,等.半夏泻心汤含药血清血清对豚鼠胃窦平滑肌细胞的影响[J].中国公共卫生.2010,(9):1 150-1 151.

[3]Xu WX,et al: Role of actin microfilament in osmotic stretch-induced increase of voltage-operated calcium channel current in guinea-pig gastricmyocytes[J].Pflugers Arch.1997,434: 502-504.

[4]CUI Yi-Feng,Li Lin, Yu-Yong-Cun,Jin Zheng-Yuan,Role of unsaturated fatty acids in the process of hyposmotic membrane stretch enhanced-muscarinic current in guinea pig smooth muscle cells[J].Acta Physiologica Sinica.2003,55:96-100.

[5]Xing DG, Huang X, Li CH, Li XL, Piao LH, Gao L, Zhang Y, Kim YC, Xu WXMuscarinic activity modul ated by C-type natriuretic peptide in gastric smooth muscles of guinea-pig stomach[J].Regul Pept.2007 Oct 4,143(1-3):83-89.

[6]姚涛 袁秀珠.Cajal间质细胞介导的糖尿病大鼠胃离体平滑肌条收缩功能的研究[J].临床消化病杂志.2011,23(3) :156-159.

[7]丁晓玲 陈捷 吴琛,等.健儿散对厌食症幼鼠胃窦Cajal间质细胞的影响[J].浙江中医杂志.2012,47(3) :205-207.

[8]Arrugia G. Ionic conductances in gastrointestinal smooth muscles and interstitial cells of Cajal[J].Annu Rev Physiol. 2011,61:45-84.

[9]Mostafa RM,Moustafa YM,Hamdy H.Interstitial cells of cajal,the Maestro in health and disease[J].World J Gastroentero l,2010,16(26):3 239-3 248.

[10]Piao L, Li Y, Li L. Increment of calcium-activated and delayed rectifier potassium current by hypos -otic swelling in gastric antral circular myocytes of guinea pig[J].Acta Pharmocol Sin 2011,22: 566-572.

[11]徐寅,郭璇,弭艳红,等.舒胃汤对功能性消化不良大鼠P物质与胃窦Cajal间质细胞的影响[J].中国实验方剂学杂志.2012,18(6) :207-209.

[12]卢光新,胡俊华,杨艳果,等.Cajal间质细胞在实验性胃溃疡大鼠食管及胃动力障碍中的作用[J].中华消化杂志.2012,32(2):126-127.

[13]刘登群,龙爽,王军平,等.成年C57BL/6小鼠空肠Cajal间质细胞的分离、培养及鉴定[J].胃肠病学和肝病学杂志.2011,20(6) :538-541.

[14]姚东英,刘菲.糖尿病胃轻瘫发病机制的研究进展[J].国际消化病杂志.2011,31(1) :16-17.

[15]宁月季,张蔚. Cajal间质细胞与糖尿病胃轻瘫的关系[J].胃肠病学和肝病学杂志.2011,20(1) :90-92.

[16]周英豪.Cajal间质细胞与胃肠道疾病[J].医学综述.2012,18(13):1 998-2 001.

广州市中医药中西医结合科研课题资助(项目编号:2010A33号)。

**作者简介:张燕(1978-),女,主治医师,医学硕士,主要从事临床病理学而及相关科研研究,Tel:18022440260,E-mail:2817621@qq.com。

R 737.11

A

2013-03-27)

猜你喜欢

胃轻瘫胃窦豚鼠
超声引导下针刺足三里穴对胃窦收缩功能的影响:随机对照研究
枳实消痞汤口服联合足三里、上巨虚、三阴交针刺治疗胃癌术后胃轻瘫的临床观察
经口内镜下幽门肌切开术治疗胃轻瘫研究进展
超声诊断中晚期胃窦癌的价值与影像学研究
内镜黏膜下剥离术治疗胃窦黏膜脱垂10 例临床效果报道
肺豚鼠耳炎诺卡菌病1例
做瑜伽的小豚鼠
X线分析消化道气钡双重造影胃窦变形临床体会
邱保国教授治疗糖尿病胃轻瘫经验
豚鼠奥运会