红景天对大鼠运动性肾缺血再灌注血清和肾组织中IL－1β、TNF－α、IL－6和IL－18水平的影响

郭爱民，曹建民，周海涛

(1.中国石油大学，北京102249;2.北京体育大学，北京100084;3.北京联合大学 生物化学工程学院，北京100023)

中医认为，运动过度则元气耗损，气损则力竭。极限负荷训练产生的疲劳，初则伤脾，久则伤肾。肾为先天之本，主骨骼生精髓。机体在稳定状态下，肾血流量可以通过自身调节机制来维持相对恒定。但在剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于各器官血流量重新分配，使得活动器官特别是肌肉的血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动过程的持续和强度递增表现的更加明显［1］。肾脏的这种不完全缺血状态形成了“运动性肾缺血”。运动停止后，肾血供应恢复形成运动性肾缺血后的“再灌注”［2］。肾脏缺血再灌注目前是医学领域的研究热点.目前研究认为肾脏缺血再灌注发生的机制与肾脏自由基代谢紊乱、能量代谢障碍、炎症损伤、钙代谢紊乱、细胞凋亡、内皮功能紊乱等有关，而细胞因子的变化与肾脏缺血再灌注损伤更是密切相关［3］，是当前的研究热点。随着现代中医药理论的发展、现代药理学理论及现代生物技术的更新，更多的单剂或配伍组方应用于体育实践。中药以其多靶点、多途径作用且几乎不含违禁成分的特点，日益在提高运动员身体机能及缓解疲劳方面显示出独特的优势。目前运动性肾缺血再灌注损伤中肾脏细胞因子及相关基因的表达尚未见有直接的研究报道。本实验选用红景天，结合前期研究，观察其对过度训练大鼠肾脏炎性细胞因子IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18蛋白及基因表达的抑制作用，探讨其对大鼠运动性肾脏缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物和分组

清洁级75只雄性Wistar大鼠，49天龄，体重(196.95±11.36)g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，动物生产合格证编号SCXK(京)2006－0008。实验中，实验室温度保持在(22±2)℃，相对湿度55% ～75%，光照时间随自然变化。大鼠以基础饲料(北京大学医学部实验动物科学部提供)和蒸馏水常规饲养，自由饮食。实验时间63天，正式训练56天。动物实验于北京体育大学运动营养实验室完成。

大鼠适应性饲养4天后，以20 min·d－1的运动量对其进行为期3天的筛选，淘汰个别不适应的游泳者，剔除不符合实验要求的大鼠，剩余大鼠以数字随机分组法分为4组:对照组(C组，12只)、一般训练组(M组，12只)、过度训练组(OM组，24只)和红景天+过度训练组(ROM组，24只)。采用专业灌胃器每天灌胃一次，ROM组剂量为4.48 g·kg－1，灌胃体积为5 mL·kg－1，其他各组灌胃等量生理盐水。

1.2 实验用药

红景天(Rhodiola)产自河北，北京同仁堂购得，批号:130413537，并经天津中瑞药业有限公司高占友高级工程师鉴定。称取红景天干品50g加水500mL，浸泡30min后煎30min，将所得水煎液过滤，再将过滤出的红景天加水500mL煎30min，将所得水煎液过滤。将2次过滤出的水煎液混合，浓缩至生药浓度1g(生药)/mL，4℃存放备用。

1.3 训练及测试方案

C组常规饲养，不运动，无任何干预。M组进行正式中等强度游泳训练8周，每周6天，每天1次，第1次下水游20分钟，此后逐渐增加，至第1周末每天游60min，第2周末加至每天游90min，第3周末加至每天游120min，此后5周均保持此运动量。OM组和ROM组前3周训练同M组，第4周起开始安排高强度训练。大鼠进行负重游泳，每次训练至力竭。力竭标准以大鼠下沉后10s不露出水面为准。第1～3周负0.5%体重，第4周负1%体重，第5周负2%体重，每天训练1次。第6周每天上、下午各训练1次，第7～8周，每天上午、下午、夜间各训练1次，均负5%体重［4］。

C组大鼠均正常生长，无意外死亡，第8周末仍为12只。随机剔除2只，10只用于实验取材。M组大鼠均正常生长，无意外死亡发生，第8周末仍为12只。随机剔除2只，10只用于实验取材。OM组和ROM组大鼠因尾部负重，疲劳、力竭不能恢复及训练意外死亡等原因，死亡率较高。至第8周末时，OM组24只仅剩11只，随机剔除1只，10只用于实验取材;ROM组24只仅剩14只，剔除4只，10只用于实验取材。

1.4 指标测定

末次游泳训练24小时后，各组大鼠乙醚适度麻醉，颈总动脉取血，加入柠檬酸钠溶液抗凝，37℃水浴30 min后，4℃、3000 r/min离心10 min，分离制备血清，置－20℃冰箱中保存待查。迅速取双肾，剔除筋膜，置于预冷的生理盐水中洗净血污，观察肾脏大小、色泽、质地，切取肾组织，分别用消毒铝箔包好，迅速投入液氮暂存，随后保存于－70℃冰箱冻存待测。

取部分肾组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4 μm厚切片，进行HE染色和组织病理学及免疫组化分析。另取部分皮质，4%戊二醛固定，超薄切片机制成50 nm的超薄切片，用日本产JEM－1200EX透射电镜观察超薄切片(×8 000倍)肾小球基底膜的厚度，每张电镜切片随机选择8个包含肾小球基底膜的视野，观察基底膜厚度、系膜基质及足突变化情况，并摄像。电子染色进行超微结构分析。

采用Jaffe苦味酸法测定血清肌酐，采用二乙酰－肟法测定血尿素氮，采用酶联免疫吸附法(ELISA)测试血清IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白表达，采用免疫组织化学法测定检测肾组织 IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白表达，采用RT－PCR法测定肾组织IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18基因表达。以上试剂盒均由上海恒远生物科技有限公司提供(批号:130403237)。

1.5 肾脏病理变化评价

参照Pallers标准［5］，400倍光镜下随机选5个视野，每个视野选10个肾小管评分。肾小管明显扩张，细胞扁平为1分;刷状缘损伤为1分;脱落为2分;细胞膜大泡为1分;细胞浆空泡为1分;间质水肿1分;肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1分;形成管型或碎片为2分。肾小管评分由两名技术员双盲计算，取平均值。

1.6 数理统计法

采用SPSS 12.0软件对所有数据进行处理，数据用平均数±标准差(±s)表示，组间差异采用方差分析，等级计数资料采用秩和检验分析，相关关系采用Pearson相关分析。显著性水平为P＜0.05，非常显著性水平为P＜0.01。

2 结果

2.1 肾组织病理改变

2.1.1 光镜观察(图1)C组和M组大鼠肾组织结构正常，无淤血、变性和水肿，肾小管管腔内无管型。OM组大鼠肾小球有淤血，小管上皮细胞水肿、空泡变性、管腔扩张，管腔有少量脱落绒毛和上皮细胞，以及各种管型。ROM组大鼠组织学改变较OM组轻，小管上皮细胞有轻微水肿、空泡变性，管腔扩张现象，无蛋白管型和细胞管型。C组大鼠肾小管Paller评分与M组比较无显著差异(P＞0.05)，OM组和ROM组显著高于C组(P＜0.01)，ROM组显著低于OM组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠肾小管损害评分比较

图1 4组大鼠肾组织病理(HE，×400)

2.1.2 电镜观察(图2)C组大鼠肾小球基底膜均匀，无增厚，系膜区不扩大，系膜细胞无明显增多，上皮足突排列整齐，结构正常。M组大鼠基底膜偶见轻微增厚，系膜区不扩大，系膜细胞不增多，滤过膜结构正常，上皮足突无融合。OM组大鼠部分基底膜呈不规则节段性增厚，系膜基质明显增多，系膜细胞增生，上皮细胞足突广泛融合。ROM组大鼠仍有较轻系膜区扩大和基底膜呈不规则节段性增厚，上皮细胞足突融合不明显，病变程度明显减轻。

图2 4组大鼠肾组织超微结构的影响(×8 000)

2.2 血尿素氮和血清肌酐

表2显示:C组血清尿素氮和肌酐水平与M组比较无显著性差异(P＞0.05)。ROM组和OM组显著高于C组(P＜0.01);ROM组显著低于OM组(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血尿素氮和血清肌酐水平比较

2.3 血清 IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白表达

表3显示:血清 IL－1β、L－6、TNF－α、IL－18蛋白水平，均为C组与M组无显著性差异(P＞0.05)。ROM组、OM组(P＜0.01)高于C组;ROM组(P＜0.05)低于OM组。

表3 各组大鼠血清IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白表达比较

2.4 肾组织IL－1β、IL－6、TNF－α、IL－18蛋白水平

2.4.1 IL－1β蛋白水平 表4显示:C组和M组大鼠肾脏组织IL－1β水平仅轻度表达，且两组比较无显著性差异(P＞0.05)。OM组阳性表达较强，ROM组表达减轻，两组比较有显著性差异(P＜0.05)。ROM组、OM组与C组比较有显著性差异(P＜0.01)。

表4 各组肾组织IL－1β蛋白水平比较

2.4.2 IL－6蛋白水平 表5显示:C组和M组大鼠肾脏组织IL－6蛋白水平仅轻度表达且无显著性差异(P＞0.05)。OM组阳性表达较强，ROM组表达减轻，两组比较具有显著性差异(P＜0.05)。ROM组、OM组和C组比较有显著性差异(P＜0.01，P＜0.05)。

表5 各组肾组织IL－6蛋白水平比较

2.4.3 TNF－α蛋白水平 表6显示:C组和M组大鼠肾脏组织TNF－α蛋白水平仅轻度表达且无显著性差异(P＞0.05)。OM组阳性表达较强，ROM组表达减轻，两组比较有显著性差异(P＜0.05)。ROM组与OM组和C组比较有显著性差异(P＜0.05)。

表6 各组肾组织TNF－α蛋白水平比较

2.4.4 IL－18蛋白水平 表7显示:C组和M组大鼠肾脏组织IL－18蛋白水平仅轻度表达且无显著性差异(P＞0.05)。OM组阳性表达较强，ROM组表达减轻，两组比较具有显著性差异(P＜0.05)。ROM组与OM组和C组比较具有显著性差异(P＜0.05)。

表7 各组肾组织IL－18蛋白水平比较

2.5 肾组织IL－1β mRNA、IL－6 mRNA、TNF－α mRNA、IL－18 mRNA相对表达量

表8显示:C组肾脏组织 IL－1β mRNA、L－6 mRNA、TNF－α mRNA、IL－18 mRNA表达水平与M组比较均无显著性差异(P＞0.05)，ROM组和OM组显著高于C组(P＜0.01)，ROM组显著低于OM组(P＜0.05)。

表8 各组肾脏组织IL－1β mRNA、IL－6 mRNA、TNF－α mRNA、IL－18 mRNA相对表达量比较

3 讨论

红景天(Rhodiola)是景天科(Crassulaceae)红景天属(Rhodiola.L)多年生草本或亚灌木植物，生长在海拔800～2 500m高寒无污染地带。《本草纲目》记载“红景天，本经上品，祛邪恶气，补诸不足”，是“已知补益药中所罕见”。由于生长环境恶劣，使其从遗传上具备了特殊的适应性物质，与人参、刺五加、绞股蓝并称为植物性滋补强壮剂，具有适应原样(Adoptogen)作用。现代医学研究证明，红景天具有显著的抗衰老、抗缺氧、抗不良刺激、抗病毒及肿瘤、抗疲劳和对机体双向调节等药理机制［6］。缺血再灌注损伤是一个十分复杂而又普遍存在的过程。肾脏是高灌注器官，对缺血再灌注十分敏感，当缺血持续一定时间再重新恢复血流灌注后，有时不仅不能使组织结构和功能恢复，反而加重肾脏功能障碍和结构损伤，这被称为肾脏缺血再灌注损伤［5］。机体在稳定状态下，肾血流量通过自身调节机制维持相对恒定。剧烈运动时，肾血流在神经和体液因素的影响下发生改变。由于血流量重新分配，肌肉血流量增多，肾血流量急剧下降，并伴随运动持续和强度递增更加明显。这种肾脏不完全缺血状态形成运动性肾缺血。运动停止后，肾血供恢复。运动及恢复期肾血流量两个时相的改变导致运动性肾缺血后再灌注［2］。近年来，随着对细胞因子网络认识的迅速提高，有关器官缺血再灌注(I/R)时细胞因子的作用日益受到重视。肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF－ α)、白细胞介素－1β (interleukin－1β，IL－1β)，IL－6和 IL－18等在肾缺血再灌注损伤过程中起重要作用。已有研究表明肾缺血时，肾组织局部可产生多种炎症介质，其中包括TNF－α。TNF－α是创伤或感染后机体最早产生的多功能细胞因子之一，它可刺激单核巨噬细胞合成和分泌IL－18，IL－1等炎症介质，并能协同扩大其生物学效应。TNF－α可通过增强中性粒细胞(PMN)上CD11/CD18的表达，诱导血管内皮细胞选择素的表达，增强缺血时PMN与血管内皮细胞(VEC)的载附，促进PMN的激活、外渗与浸润，导致组织的损伤。还可促进肾小球内皮细胞、成纤维细胞和肾小管上皮细胞大量产生IL－18。α不仅可介导中性粒细胞的聚集和激活，而且还增强PMN表面CD11/CD18(MCA－1)分子的结合性，增强与VEC的载附和迁移，使大量PMN在肾组织内聚集和浸润，加剧肾缺血再灌注损伤。IL－6作为一个重要的急性期反应因子，在创伤、炎症等病理情况下多表现为增加。TNF－a可以刺激IL－6的产生，二者又往往协同刺激急性期反应［7］。IL－1β是一种在炎症反应中最早出现的起着前炎症因子作用的反应强烈的细胞因子。大量的研究表明，缺血再灌注性损伤早期产生的粘附因子和细胞因子是构成缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。目前已证明IL－1β在各种缺血再灌注损伤中起着重要的作用［8］。IL－18是炎细胞因子和IFN－γ诱生因子，主要由活化的单核巨噬细胞产生。正常仅肾脏有微量的IL－18表达。肌酐和尿素氮分别是肌肉和蛋白质的分解代谢产物，主要经血循环经肾脏排除体外。血肌酐和尿素氮浓度取决于肾小球滤过能力，当肾实质受到损伤，肾小球滤过率降到临界点后，二者浓度明显上升。运动训练导致大鼠肾缺血再灌注损伤时，血清IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18水平可作为反映运动性肾缺血再灌注损伤严重程度的指标，且与肌酐和尿素氮成正相关［4］。本实验结果表明，8周的过度训练通过显著提高肾脏组织的IL－1β mRNA、TNF－α mRNA、IL－6 mRNA、IL－18 mRNA 表达，进而使得过度训练大鼠血清和肾脏组织IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18蛋白表达上调，这些细胞因子明显地促进了肾脏组织的炎性作用，导致了过度训练大鼠肾组织超微结构严重破坏、组织发生明显的病理学改变，肾脏功能受到严重损伤［9］;过度训练组大鼠血清尿素氮和肌酐水平显著升高，也证实了过度训练组大鼠肾脏功能的降低［10］。一般训练组大鼠肾组织IL－1β mRNA、TNF－α mRNA、IL－6 mRNA、IL－18 mRNA表达与对照组比较变化不大，其血清和肾组织IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18蛋白表达同样变化不大，表明一般训练没有引起这些致炎性细胞因子在基因水平和蛋白水平的变化，并且在肾脏组织的超微结构和病理学水平同样没有引起明显的改变，肾脏功能正常。红景天+过度训练组大鼠肾脏组织IL－1β mRNA、TNF－α mRNA、IL－6 mRNA、IL－18 mRNA表达与过度训练组比较显著降低，血清和肾组织IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18蛋白表达显著下调，血尿素氮和肌酐水平显著降低，表明红景天补充通过抑制肾脏组织这些炎性细胞因子的基因表达，进而降低这些炎性细胞因子在肾脏组织和血清中的蛋白水平的表达，进而从基因到蛋白质水平抑制由于过度训练对肾脏缺血再灌注诱导的肾脏组织炎性细胞因子的表达，减缓了过度训练对肾脏缺血再灌注的损伤影响，有效地减轻肾功能障碍、肾脏组织超微结构破坏程度及组织病理学改变。其机制可能为:一是通过提高肾缺血再灌注损伤组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，维持肾脏组织细胞膜的完整性与稳定性，从而阻止炎性细胞因子的过度生成。目前已知氧自由基介导的脂质过氧化反应是肾缺血再灌注损伤的重要环节。SOD具有清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤的作用。①红景天的主要成分红景天苷和苷元酪醇，都具有酚羟基。酚羟基作为清除自由基的主要功能基团，可通过清除体内过量生成的自由基对机体细胞的损伤，激活抗老化酶(SOD)的活性，降低脂质过氧化物(LPO)的浓度，抑制脂褐素在组织细胞中的堆积［11］。红景天中含有的多元酚类化合物、黄酮类化合物和超氧化歧化酶等也具有抗氧化作用，可以提高大鼠运动时自由基的消除;②红景天多糖自动氧化，产生新的有机自由基，使多糖本身产生自由基与它清除的自由基达到或超过平衡，从而提高大鼠运动时自由基的消除。③红景天内含Cu－Zn－SOD与Mn－SOD，是重要的超氧自由基清除剂，直接提供并增加SOD水平［12］。二是免疫双向调节作用，即红景天能够维持体内免疫系统处于平衡状态，既能提高机体免疫功能，又能防止免疫系统的矫枉过正，从而阻止炎性细胞因子的过度生成［13］。三是转化生长因子－β1(TGF－β1)可以促进肾脏细胞肥大，增加肾脏细胞外基质的产生，减少肾脏细胞外基质的降解以及刺激合成肾脏细胞外基质受体、触发细胞与细胞、细胞与外基质的相互作用。肾脏在缺血再灌注时，TGF－β1表达增加，从而造成肾脏细胞外基质增加，导致缺血再灌注肾脏损害。红景天可以抑制肾皮质TGF－β1的过度表达，因此有利于维持肾脏细胞外基质的正常代谢，保护了肾脏功能和结构［14］。四是红景天能增加CD4+T细胞，而CD4+T细胞能分泌IFN，红景天可通过促进IFN活性，减少循环免疫复合物形成、TNF－α和IL－6水平降低，从而减轻肾脏缺血再灌注免疫炎性损害和改善肾功能［15］。五是红景天可以促进抗凋亡基因Bcl－2表达，抑制促凋亡基因Bax表达，使Bax/Bcl－2表达趋向平衡，从而抑制 Caspase3的激活［16］。六是巨噬细胞能合成分泌TNF、白介素等多种细胞因子。红景天的主要成分红景天苷能抑制巨噬细胞释放IL－1、IL－6与TNF，从而减轻肾脏缺血再灌注免疫炎性损害，保护了肾脏功能和结构［18］。但实验结果也表明红景天+过度训练组血尿素氮、血清肌酐、蛋白表达和基因表达与对照组比较有显著性差异，提示红景天对大鼠运动性肾缺血再灌注损伤有保护作用，但仍未达到无损伤程度。

4 结论

红景天明显减轻运动性肾缺血再灌注引起的肾功能障碍和肾脏组织超微结构破坏程度及组织病理学改变，通过抑制炎性细胞因子 IL－1β、TNF－α、IL－6、IL－18表达，提高机体免疫和耐受各种应激刺激能力，减轻过度训练导致的运动性缺血再灌注对肾脏的损害。

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