电位滴定法测定苦瓜中总生物碱的含量*

石雪萍，汪洪涛，余芳，陈成

(江苏经贸职业技术学院工程技术学院，江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京，210007)

苦瓜(英文名:bitter melon，bitter gourd;拉丁名:Momordica charantiaL. )为葫芦科苦瓜属植物，性味苦寒，因味苦得名。苦瓜不仅含有人体必需的营养成分，还含有其他功效成分而具有清热解凉、滋养强壮、降血糖等功效［1］。

生物碱是存在于自然界中的一类含氮的碱性有机化合物，有似碱的性质。苦瓜中也含有生物碱成分。1990 年，Handa 等［2］从脱脂苦瓜中分离出一种具有降血糖活性的乙二醇-生物碱——蚕豆苷。肖志艳等［3］用体积分数95%乙醇对新鲜苦瓜热浸提取，浓缩提取液以氯仿-水分配，将氯仿层蒸干得干膏，该部分经反复硅胶柱层析可分离得到β-谷甾醇(β-sitosterol)，还得到了苦瓜脑甙(momorcerebroside)和大豆脑甙(soyacerebroside)这2 个酰胺类化合物以及一种生物碱尿嘧啶(uracil)。1981 年，Akhtar 等［4］研究了苦瓜对正常及含四氧嘧啶的家兔血糖的影响，推测苦瓜内降糖活性物质包括一种生物碱和一种类似胰岛素的化合物。

关于生物碱的测定方法，已报道的有酸性染料比色法［5－6］、酸碱滴定法［7］、高效液相色谱法等［8］。各种方法既有其优缺点，也有局限性。如酸性染料比色法需要对照品，每一步操作均需要氯仿萃取，样品处理复杂，误差较大;酸碱滴定法滴定终点难以控制，误差较大;高效液相色谱法需要标准品、价格昂贵，且只能给出特定物质的含量，操作也较繁琐。本文利用苦瓜生物碱的碱性，探讨利用电位滴定法测定苦瓜中总生物碱含量的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验原料与试剂

苦瓜(干)，购于超市;奎宁(对照品)，上海纯优生物科技有限公司;乙醇、浓氨水、石油醚、三氯甲烷、氢氧化钠、浓硫酸、邻苯二甲酸氢钾等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

电位滴定仪，PHS-3C (上海佑科仪器仪表有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(金坛市江南仪器厂);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理

苦瓜干经粉碎机粉碎，过40 目筛，得到苦瓜干粉，用20 倍石油醚萃取3 次，每次12h。去除油脂和脂溶性色素后，干燥备用。

1.3.2 溶液制备

NaOH 和H2SO4溶液的配制与标定［9］:称取1.664 2 g 固体NaOH 于烧杯中，加水搅拌至溶解移于容量瓶中，用蒸馏水冲洗烧杯内壁数次，洗涤液一并转入容量瓶中，定容至1 000 mL。准确称取0.4 ～0.5g 邻苯二甲酸氢钾3 份，分别于250 mL 锥形瓶中，加入50 mL 水使之溶解。再加酚酞指示剂2 滴，用待标定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微红色，30 s 不褪色即为重点。记录所用NaOH 体积，最终得NaOH平均浓度为0.043 mol/L。H2SO4溶液的配制与标定:用量筒量取浓H2SO41 mL，注入1 000 mL 的容量瓶中，加水定容至1 000 mL。准确量取10 mL 配好的H2SO4溶液3 份，分别于250 mL 锥形瓶中，用已标定的NaOH 溶液滴定至溶液呈微红色，30 s 不褪色即为重点。记录所用NaOH 体积，最终得H2SO4平均浓度为0.019 mol/L。

1.3.3 苦瓜生物碱的提取

本实验选用4 种提取方法。

(1)酸水提取法:称取样品1 g，用50 mL 的1%的HCl 浸提(温度为70℃)2 h，提取3 次，抽滤取滤液，用浓氨水调节pH 至中性，然后用等体积的氯仿萃取3 次，合并滤液。蒸发去除溶剂，得到样品1#。

(2)乙醇回流法:称取样品1 g，加入50 mL 乙醇，回流提取2 h，提取3 次，抽滤，合并滤液，挥干，得到样品2#。

(3)超声波辅助提取法:称取样品1 g，加入50 mL 的70%乙醇，超声波辅助提取1 h，提取3 次，抽滤取滤液合并，去除溶剂，得到样品3#。

(4)碱浸泡提取法:称取样品1 g，用浓氨水浸润，过夜。分别用50 mL 超声波辅助提取3 次，抽滤取滤液，去除溶剂，得样品4#。

1.3.4 电位滴定测定生物碱

将1.3.3 中的4 种供试液置入250 mL 三角瓶中，挥干溶剂，加入1.3.2 标定好的硫酸溶液20 mL，超声处理使其完全溶解。将复合电极插入溶液中，选择mv 模式，开启搅拌器，开始滴定，并记录氢氧化钠消耗的体积和对应的电动势，直到最终的电动势趋于平缓，停止滴定。以空白试验校正。采用ORIGIN 软件绘制一阶导数曲线△E/△V—V，一阶导数曲线最高点对应的体积即为滴定终点体积［10］。

1.3.5 生物碱含量计算

苦瓜生物碱的含量(mg/g)计算以奎宁(分子质量324)为基准，按照下式计算［11］:

2 结果与讨论

2.1 电位滴定

按照1.3.4 的滴定结果对消耗的NaOH 体积和电动势作图(以4#样品中的其中一个实验为例)，再对电动势求一阶导数，一阶导数对体积作图，峰尖所对应的值即为滴定终点。电位滴定如图1。

图1 电位滴定图(4#)Fig.1 E V graph of the potentiometric titration

2.2 几种方法提取的样品中生物碱的含量

按照1.3.4 下的方法测得几种提取方法得到的生物碱含量见表1。

表1 不同提取方法得到的苦瓜中生物碱含量Table 1 Alkaloids Contents of the Momordica charantia L with different extraction methods

由表1 看出，4 种提取方法中，碱浸法提取苦瓜生物碱的得率最高，其次是超声波辅助提取，乙醇回流法苦瓜生物碱得率最低。

2.3 精密度试验

取同批供试品，精密称定6 份，用碱液浸泡提取生物碱，按照1.3.4 方法操作，分别测定供试品中总生物碱，测定结果的R S D 为0.23%，表明该方法稳定。

2.4 稳定性试验

称取供试品5g，按照4#样品制备方法提取，提取液分为6 等份，加硫酸完全溶解，分别于0、1、2、3、4、5 h 按1.3.4 方法滴定，NaOH 消耗体积数的RSD为0 .37%，实验表明该方法在5 h 内具有良好的稳定性。

2.5 重复性试验

取同批苦瓜试样6 份，精密称定，按4#样品制备方法提取供试品并按1.3.4 项下方法测定，测得苦瓜中总生物碱的含量测定结果RSD 为5.3%，表明该测定方法具有良好的重复性，符合含量测定的要求。

2.6 加标回收率试验

取已知生物碱含量的样品(4#)5 份，分别加入奎宁对照品，按照1.3.4 的方法滴定、1.3.5 的方法计算，求得加标回收率为90.8%，RSD 为4.30%。结果见表2。

编号 已知样品量/mg加入对照溶液所含生物碱量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1 3.24 1.814 4.536 89.8 90.8 4.30 2 3.24 1.814 4.860 96.2 3 3.24 1.814 4.324 85.6 4 3.24 1.814 4.536 89.8 5 3.24 1.814 4.676 92.5

加标回收实验进一步说明了此种方法测定苦瓜生物碱的含量具有良好的重现性。

3 讨论

采用强碱滴定强酸，以过量的强酸来中和有机弱碱，以电动势突跃判定滴定终点，根据求一阶导数精确求出滴定终点，这种方法实现了对苦瓜总生物碱的定量，试验表明这种方法简便灵敏且稳定可靠。对几种生物碱提取方法进行对比结果显示，碱液浸泡法生物碱得率最高，说明苦瓜中的生物碱大多以大多数生物碱是以盐的形式存在于植物中，用氨水浸润后使其转为游离态。由于游离态生物碱多不溶于水而溶于有机试剂，因此苦瓜生物碱的提取可以通过先碱化再用有机试剂提取的方法。

作者曾经研究过用酸性染料比色法［12］和酸碱滴定法［13］(溴甲酚绿和甲基红作指示剂)测定生物碱的含量。酸性染料比色法试验中每一步操作均需要氯仿萃取，利用氯仿相颜色的深浅来定量样品中生物碱的含量，操作较繁琐，且需要对照品来做标准曲线。用指示剂指示终点的酸碱滴定法终点不明显，主观性强，数据及不稳定。本试验采用电位滴定法在一定程度上解决了苦瓜中总生物碱不易有效定量的难题，但由于该方法是基于奎宁(苦瓜中存在的一种生物碱)作为基准来定量苦瓜中的总生物碱，离精准定量尚有一定距离，因此再对苦瓜中生物碱类进行进一步分离、含量测定后重新选取基准物质，来对这种测定方法加以完善，更好地对苦瓜进行质量控制。

［1］ 江苏新医学院编. 中药大辞典［M］． 上海:上海科技出版社，1985:1 281.

［2］ Handa，G J Singh，Sharma M L，et al. Hypoglycemic Principle of Momordica charantia Seeds［J］． Indian J Nat Prod，1990，6(1):16 －19.

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［4］ Akhtar M S，Athar M A，Yaqub M. Effect of momordica charantia on blood glucose level of normal and alloxan-diabetic rabbits［J］． Plant Medica，1981，42:205 －212.

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