不同氨基酸对普洱茶发酵过程中多酚类物质转化及品质的影响

2013-10-30凌萌乐刘通讯

食品与发酵工业 2013年5期

凌萌乐，刘通讯

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州，510640)

普洱茶作为我国的传统名茶之一，主要以云南大叶种晒青毛茶为原料，根据其后续加工工序的不同可分为“生茶”和“熟茶”，熟茶与生茶的区别在于，熟茶是经渥堆发酵和一系列后续工序快速成熟陈化而制得的。加工完成后的熟茶外形色泽红褐，内质汤色红浓明亮，香气陈香而独特，滋味醇和回甘，叶底红褐，具有降血压、降血脂［1］和抗衰老［2］等多种保健功效。在普洱熟茶的制作过程中，渥堆发酵是最为重要的一步，直接决定着产品的质量，所以改善渥堆工艺对普洱茶品质的提高有着重要的意义，目前，国内外关于工艺方面的探究主要集中在添加外源酶类、改变潮水量和人工接种微生物等方面［3］，并且在揭示品质的形成机理方面也进行了大量的研究［4］，但是对于通过添加外源氨基酸来改善发酵工艺以及发酵过程中酚类物质之间的转化关系研究较少。氨基酸作为普洱茶发酵过程中的重要参与物质，其本身又是呈味物质，对普洱茶滋味和色泽的形成都起着非常重要的作用。本研究在一定潮水量、翻堆间期和翻堆次数的条件下，添加6 种具有代表性的外源氨基酸来探究其对普洱茶发酵过程中茶多酚、儿茶素和茶色素变化的影响，并对以上成分的相关性进行分析，得出它们在发酵过程中的变化规律。将最终发酵产品的感官评定和茶汤的光学特性与市售陈年普洱茶进行对比分析，以评价外源氨基酸对普洱茶发酵品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大叶种晒青毛茶(2011 年)云南腾冲;云南七子饼茶(03、05、07 年产熟普，中国云南西欧双版纳勐海国营黎明茶厂出品;谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸，上海伯奥生物科技有限公司。

ESJ200—4 电子分析天平，上海精科电子有限公司;UV752N 型分光光度计，上海棱光技术有限公司;富华420 型三用水箱，金坛市富华仪器有限公司;DHG90A 电热恒温鼓风干燥箱，上海索普仪器有限公司;CR-400 便携式色彩色差计，Chroma meter;循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

加水增湿至茶堆含水量为45%，实验组加入干茶重量0.6%的相应氨基酸［5］，对照组(CK)不添加氨基酸。然后进行实验室模拟渥堆发酵，渥堆过程中，每6 天进行一次翻堆，共翻堆4 次，翻堆之前对茶堆的芯层和表层进行取样［6］。(实验进行时间2012年9 ～12 月，环境温度为17 ～26℃)。

1.3 指标测定

茶多酚(TP)的测定:GB/T 8313 －2002;儿茶素总量的测定:香荚兰素比色法;茶黄素(TF)、茶红素(TR)、茶褐素(TB)的测定:比色系统分析法［7］。普洱茶的光特性分析方法:精确称取普洱茶茶样3.000g，加入150ml 沸水，冲泡5min，单层滤纸过滤，茶汤滤液冷却至室温后用色彩色差计测L*、a*、b*值，测定3 次，取平均值。

1.4 数据分析

用Microsoft Excel 2007 对数据进行处理与作图，采用SPSS19.0 对数据进行方差分析、相关性分析和回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同氨基酸对普洱茶发酵过程中堆温变化的影响

在普洱茶渥堆发酵过程中，适宜的温度不仅为微生物的滋生和活动创造了良好条件，也为茶叶内含物质的转化和生成创造了条件，这对酚类物质的氧化聚合尤为重要，所以在普洱茶发酵前期保持一定的堆温对普洱茶品质的形成有着重要的作用。由图1 可知实验组在渥堆前期(7d 之前)堆温明显高于对照组，最高温度达48 ～55℃，说明外源氨基酸能够增强发酵过程中生化反应，加快反应产热，使堆温达到较高的水平，从而有利于茶叶内部物质的转化和生成。当发酵进行到一定程度时，生化反应活性降低，堆温随之降低。

图1 不同氨基酸处理下渥堆过程中堆温的变化Fig.1 Changes of pile temperature during fermentation process under different amino acids treatment.

2.2 不同氨基酸对普洱茶发酵过程中茶多酚和儿茶素含量变化的影响

茶多酚和儿茶素在很大程度上决定了茶叶的滋味，并且这两者又是生成茶色素的前体物质，与茶色素的变化紧密相关，所以其变化对普洱茶的滋味和色泽有着重要的影响［8］。实验结果表明，第4 次翻堆结束后，茶多酚减幅最大的是谷氨酸组，达92.1%(表层和芯层减幅的平均值，下同);减幅最小组为亮氨酸组，达67.3%。由图2 －A 可知，与对照组相比在渥堆前期外源氨基酸对茶多酚的减少量影响不大(P＞0.05)，说明外源氨基酸与茶多酚的减少和转化的关系不明显，但实验组总体的减幅均大于对照组的66.7%，这可能是由于茶多酚作为一种混合物，它包含类黄酮、黄酮类、黄酮醇类、花色苷类、异黄酮等物质［9］，它的减少和变化受到如发酵过程中的湿热环境、多酚氧化酶酶活等众多因素的影响。

儿茶素属黄烷醇类物质，是2-苯基苯并吡喃的衍生物，性质活泼，约占多酚总量的70% ～80%。儿茶素的B 环酚羟基易氧化形成邻醌，而邻醌又很不稳定，易发生复杂的聚合、缩合反应，而形成双黄烷醇类、茶黄素类和茶红素类等［10］。由图2 －B 可知，在二翻之后，外源添加氨基酸能明显加快儿茶素的减少和转化，三翻时对照组与实验组儿茶素含量的差异达到极显著水平(P ＜0.01)，四翻结束后，儿茶素减幅最大的是亮氨酸组达97.4%，减幅最小组苯丙氨酸组达94.85%，均大于对照组的84.8%。在儿茶素氧化的过程中，氨基酸与其氧化产物结合，通过氧化脱氨和偶联氧化途径，生成相应的醛类等独特的香气化合物，形成茶叶的基本风味。实验结果表明添加外源氨基酸能加快儿茶素的氧化和转化，儿茶素的氧化聚合产物是茶色素形成的前提物质，所以，这一反应将对接下来茶黄素、茶红素的变化和茶褐素的积累产生重要影响。

图2 不同氨基酸处理下发酵过程中茶多酚(A)和儿茶素(B)含量的变化。Fig. 2 Changes of tea polyphenols(A)and tea catechins(B)content during fermentation process under different amino acids treatment.

由以上结果可知，在普洱茶的发酵过程中，茶多酚和儿茶素的含量不断减少，降低幅度在一翻到三翻之间较大，这与梁明志等［11］研究普洱茶渥堆发酵过程中理化指标的变化得出的结果一致。在同样的时间内，实验组的茶多酚和儿茶素的减幅总体大于对照组，并且也大于其他工艺条件下的降低幅度［12－13］，表明添加外源氨基酸之后能够加快茶多酚和儿茶素含量的减少，从而降低茶汤的苦涩味，促进普洱茶醇厚回甘的特点的形成。周锡樑等［14］同样在绿茶的加工过程中采用喷洒氨基酸的工艺来降低酚氨比，进而改善茶叶滋味，降低苦涩味。

2.3 不同氨基酸对普洱茶发酵过程中茶色素含量变化的影响

茶色素包括水溶性的茶黄素、茶红素和茶褐素，它们是儿茶素氧化分解聚合的产物，这3 种物质在很大程度上决定了茶汤的滋味和色泽。由图3 －A 可知，实验组和对照组在一翻时茶黄素的含量大于茶原样(晒青毛茶)，但含量变化没有一定的规律性，其原因可能与茶黄素的动态变化有关，茶黄素是由儿茶素等多酚类物质经酶促氧化生成，它是生成茶红素和茶褐素的前提物质，所以它的含量一直处于动态变化之中;由图3 －B 可知，茶红素的含量从一翻到四翻不断减少，与对照组相比，实验组茶红素含量在一翻到二翻之间有极显著下降趋势(P＜0.01)，同茶原样相比有较大的减少，从三翻到四翻，茶红素含量一直处于较低水平，这可能是因为茶红素属于中间过渡产物，发酵前期有前体物质的不断生成，但是到了后期前体物质生成减少，自身又不断被氧化，所以造成含量处于较低水平;由图3 －C 可知，实验组茶褐素含量从发酵开始到三翻不断积累，三翻时达到最大值，其含量介于6.315% ～8.108%，达到罗龙新等［15］在研究中得出的最佳汤色品质的茶褐素含量标准，在三翻之后茶褐素的含量有所下降，这在感官评价上为色泽变浅，这可能是由于添加氨基酸后茶叶内含物质的转变和转化反应过于激烈，从而使得茶褐素等物质转变为其他的物质，进而影响茶叶的品质，而对照组茶褐素从一翻到四翻不断积累，并且各阶段含量均低于实验组。

多酚类物质在湿热、微生物作用下发生酶促和非酶促氧化，通过氧化聚合，生成橙黄色的茶黄素，再进一步氧化产生红色的茶红素，茶红素很快又氧化并与含氮物质、糖类、咖啡因等物质结合，而形成暗褐色的茶褐素［16］。由本实验结果可知，若从多酚类物质依次氧化顺序产物(茶黄素-茶红素-茶褐素)来看，茶黄素由于处于较前位置，其变化没有一定的规律性，茶红素与茶褐素有直接的转化联系，所以其含量变化有较明显的线性关系。通过与对照组相比，实验组中茶褐素能较快的积累，其含量在二翻时达到显著水平(P＜0.05)，三翻时达到极显著水平(P＜0.01)，而茶褐素又是普洱茶中十分独特的品质成分，直接决定着普洱茶的品质［17］。此外，本实验也证明了外源氨基酸可以加快酚类物质向茶色素的氧化转变以及茶色素之间的转化和茶褐素的积累，氨基酸参与这些过程的途径可能为氨基酸与多酚类物质或者其氧化聚合产物发生反应，或者氨基酸与糖类物质发生美拉德反应，这些产物又与多酚类物质或者其氧化聚合产物相结合［18］。

图3 不同氨基酸处理下发酵过程中茶红素(A)、茶黄素(B)和茶褐素(C)含量的变化。Fig.3 Changes of theaflavins(B)，thearubigins(B)and theabrownins(C)content during fermentation process under different amino acids treatment.

2.4 不同氨基酸处理下的普洱茶发酵过程中茶多酚、儿茶素和茶色素之间的相关性

茶多酚是一类存在于茶叶中的多元酚类混合物，其中以儿茶素为主体，而茶黄素、茶红素和茶褐素是普洱茶的主要着色物质，目前认为这3 种物质是茶多酚的水溶性氧化产物［19］，研究他们的之间的相关性对于理解他们相互之间的氧化、降解和转化机理提供一定的理论依据，同时也能得出外源氨基酸对该变化过程的影响。所以，对不同氨基酸条件下发酵过程的指标进行相关性分析和多元回归分析。结果见表1和2。

表1 发酵过程中各项指标的相关系数及其显著性检验效果Table 1 Correlation coefficients of indexes and significant test results during fermentation process.

由表1 可知，在添加氨基酸的条件下，茶多酚与儿茶素、茶红素含量呈极显著的正相关，与茶褐素呈极显著负相关(P＜0.01)，表明随着茶多酚含量的降低，儿茶素和茶红素含量也同时降低，茶褐素的含量则不断积累。儿茶素同茶黄素和茶红素呈极显著的正相关，同茶褐素呈极显著的负相关，这表明儿茶素同这3 种色素之间的转化有着直接关系。茶黄素同茶红素呈显著的正相关(P＜0.05)，同茶褐素的相关性不显著，说明了茶黄素同茶红素的转化关系更为紧密和直接。茶红素同茶褐素呈极显著的负相关(P＜0.01)。

在普洱茶的加工过程中，茶褐素的含量明显增加，这对于普洱茶的品质的形成有着十分重要的作用［20］。为了分析影响茶褐素含量变化的因素，以茶褐素含量(Y)为因变量，茶多酚(X1)、儿茶素(X2)、茶黄素(X3)、茶红素(X4)的含量为自变量进行逐步回归分析，建立多元线性回归方程。结果见表2。将茶褐素与茶多酚、儿茶素、茶黄素和茶红素含量之间的线性关系经逐步分析后，引入回归方程的变量为儿茶素和茶黄素。同时由这2 个指标的标准偏回归系数来看，对茶褐素的作用是茶黄素大于儿茶素，对方程的方差分析及对回归系数的显著性检验表明，所建立的回归方程拟合效果理想。得到的回归方程可以把普洱茶发酵过程中茶褐素同儿茶素和茶黄素之间的关系量化，从而为普洱茶发酵过程中茶褐素、茶黄素的形成，儿茶素的氧化聚合或者降解提供一定的理论依据。

表2 多元回归分析结果Table 2 Results of multiple regression analysis

2.5 不同氨基酸处理下的发酵终产品与陈年普洱茶的对比分析

根据感官评定和相应的指标变化，确定在添加外源氨基酸的条件下发酵19d(三翻后1d)，普洱茶的汤色、香气和滋味均达最佳，然后取样在室内晾干，为发酵终产品。通过将发酵19 天的对照组普洱茶与3种陈年普洱茶的感官评定和光学特性进行对比分析，来评价发酵终产品的品质，结果见表3。由表可知，同对照组和陈年普洱茶相比，氨基酸处理的发酵终产品的汤色、香气和滋味均达到较高品质要求，L* 值同陈年普洱的基本保持一致，达到了陈年普洱茶的亮度标准;a* 和b* 值同陈年普洱茶的相差不大，说明了其较好的色泽，而对照组不管是感官还是光学特征均与陈年普洱茶相差较远。总的来说添加氨基酸的发酵终产品不管在色泽还是内质，均能够形成陈年普洱茶的品质，所以外源添加氨基酸处理能够很好的改善普洱茶的发酵过程，进而形成陈年普洱茶的优良品质。

表3 不同储存年限和氨基酸处理下的普洱茶感官评定和茶汤色分析(M±SD)Table 3 Sensory evaluation and color analysis of Pu-erh tea with different storage life and amino acids treatment.

(注:L* 为明度指标，从大到小由白色向黑色渐变;a* 为红绿色度指标，正值表示红色指标，负值表示绿色指标;b* 为黄蓝色度指标，正值表示黄色指标，负值表示蓝色指标)

3 结果与讨论

(1)外源氨基酸可以在发酵前期提高发酵温度，这可能是由于氨基酸作为氮源直接被微生物利用，影响发酵过程中微生物的新陈代谢，使其分泌丰富的胞外酶，这将对普洱茶内含成分的物理化学变化产生极大的促进作用。

(2)外源氨基酸可以在发酵过程中加快酚类物质转化，在发酵过程中，多酚类物质在微生物所分泌的酶及湿热的作用下，被氧化成初级产物邻醌，氨基酸可被生成的邻醌氧化，脱去氨基和羰基形成相应的挥发性醛类，外源氨基酸可以加大该反应的程度，此外，氨基酸与儿茶素在一定温度下可生成(7-C-乙基氨基酰-(-)-表儿茶素)，该物质将进一步变成棕褐色物质［21］，这些反应及其产物将对普洱茶的色、香、味产生很大的影响。

(3)外源氨基酸能加快茶褐素积累，茶褐素的形成存在酶促反应机制和非酶褐变机制，酶促反应主要是多酚类的氧化聚合或氧化产物的偶联聚合，在该过程中氨基酸作为一种重要物质参与其聚合反应;非酶褐变机制主要是美拉德反应，即氨基酸和糖等含羰基化合物中的羰基之间的缩合作用，前面的结果表明外源氨基酸能够促进这2 种机制的进行，进而加快茶褐素的积累。

(4)外源氨基酸可以缩短发酵周期，加快普洱茶特殊品质的形成，在相同工艺条件下，添加外源氨基酸发酵19d 即可形成普洱茶汤色红亮、醇厚回甘的品质特点，这与外源氨基酸能够加快多酚类物质的转化和茶褐素的积累紧密相关，而对照组则需要25d 才能形成相似的品质，此外添加外源氨基酸发酵的普洱茶能形成明显的滋味特征，比如添加苯丙氨酸发酵普洱茶具有兰花香，丙氨酸的具有木香，这可能与微生物作用和氨基酸本身的呈味性有关［22－23］。

总之，氨基酸可以在微生物的作用下或者其自身直接影响发酵过程中茶叶内含物的生化转变，加快普洱茶的发酵进程，提高普洱茶的发酵品质。所以，通过添加外源氨基酸的方法来改善普洱茶的发酵环境，缩短发酵周期，提高品质，同时开发新的普洱茶品种将是接下来的研究目标和重点，本文为以后的研究奠定了一定的基础。

［1］ Tzong-Der Way，Hui-Yi Lin，Daih-Huang Kuo，et al. Puerh tea attenuates hyperlipogenesis and induces hepatoma cells growth arrest through activating amp-activated protein kinase (ampk)in human hepg2 cells［J］． Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(12):5 257 －5 264.

［2］ Jie Guo-liang，Lin Zhi，Zhang Long-ze，et al. Free radical scavenging effect of pu-erh tea extracts and their protective effect on oxidative damage in human fibroblast cells［J］．Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006，54(21):8 058 －8 064.

［3］ Liu Bing-lan，Zhang Yao-nan，Chen Yu-shun，et al.Effects of bacterial strains on sensory quality of Pu-erh tea in an improved pile-fermentation process ［J］． Journal of sensory studies，2009，24(4):534 －553.

［4］刘勤晋. 普洱茶的渥堆作用［J］．茶叶科学，1986，6(2):55 －56.

［5］张秀秀，外源氨基酸和糖对普洱生茶品质的影响［D］．广州:华南理工大学硕士论文，2011:23 －26.

［6］胡捷，刘通讯. 不同潮水量下普洱茶渥堆过程中微生物及酶活变化研究［J］．食品工业科技，2012，33(17):93 －97.

［7］黄意欢. 茶学实验技术［M］．北京:中国农业出版社，1997:126 －127.

［8］何国藩，林月婵. 普洱茶色素类物质及其在沤堆过程中的变化［J］．中国茶叶，1987(4):6 －8.

［9］宛晓春. 茶叶生物与化学(第三版)［M］．北京:中国农业出版社，2003:23 －40.

［10］李大祥，宛晓春，杨昌军，等. 茶儿茶素氧化机理［J］．天然产物研究与开发，2006，18(1):171 －181.

［11］梁名志，夏丽飞，陈林波，等. 普洱茶渥堆发酵过程中理化指标的变化研究［J］．中国农学通报，2006，22(10):321 －324.

［12］赵冰，李中皓，陈再根，等. 外源多酚氧化酶对普洱茶品质的影响研究［J］．安徽农业科学，2012，40(30):14 940 －14 943.

［13］付秀娟，宋文军，徐咏全，等. 不同种类微生物对普洱茶发酵过程的影响［J］．茶叶科学，2012，32(4):325 －330.

［14］周锡樑，刘娟，祝爱，等. 外源氨基酸对茶叶的影响［J］．氨基酸和生物资源，2007，29(2):46 － 48.

［15］罗新龙，吴小崇. 云南普洱茶渥堆发酵过程中生化成分的变化及其与品质形成的关系［J］．茶叶科学，1998，18(1):58 －60.