低聚木糖的超滤纯化生产工艺优化*

章茹，曹济，刘辉，冯斐

1(南昌大学鄱阳湖环境与资源利用教育部重点实验室，江西 南昌，330046)

2(南昌大学环境与化学工程学院，江西 南昌，330031)

低聚木糖是目前国内外颇受关注的功能性低聚糖之一［1］，其制备一般是由天然原料如秸秆、玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳等经预处理及酶水解后，得到富含低聚木糖的酶解液［2］。酶解液经板框过滤后，仍含木质素、酶蛋白、未降解的木聚糖、色素、无机盐等杂质［3］，纯化过程主要包括除杂、脱色及脱盐等［4］。目前低聚木糖的纯化方法主要有色谱柱分离法、活性炭柱层析乙醇洗脱法［5］、酶法、酸碱法提取［6］、微生物发酵法及膜分离法等，其中色谱法设备投资高、操作复杂且成本高;酶法中氧化酶价格偏高，经济性较差;发酵法操作复杂且微生物选择较为困难。超滤膜分离法具有收率高、破坏小、能耗低、设备简单、可连续生产无污染等优点，可长期连续使用并保持较恒定的产量和稳定的分离效果［7］，是当前低聚糖和多糖等分离纯化研究中十分活跃的领域［8］。

关于超滤用于分离纯化糖类的文献不多。伍军等［9］研究了不同材质和孔径的超滤膜对大豆黄浆水中低聚糖和乳清蛋白的分离效果，但其并未确定最佳超滤纯化条件。孙瑜［10］在实验室条件下研究了超滤法纯化大黄多糖中超滤时间、温度、压力、pH 值等的影响。肖光耀［11］在研究大豆多肽酶解液的膜分离浓缩工艺条件中，只讨论了多肽的浓缩未明确说明分离蛋白质和糖类的效率。

本研究采用工业化超滤膜分离装置，对秸秆酶解液中的低聚木糖进行分离纯化工艺优化研究。以蛋白、木质素去除率和低聚木糖的透过率为评价指标，考察料液浓度、操作压力、温度、pH 值对超滤除杂的影响，通过Box-Behnken 模型优化确定最佳超滤工艺条件并检验该条件下的纯化效果，为秸秆酶解液中低聚木糖超滤纯化的进一步工业开发与应用提供相关参考。

1 材料与方法

1.1 主要原料与仪器

秸秆木聚糖酶解液:山东龙力生物科技股份有限公司提供，该料液经板框过滤，固形物浓度2.25°Brix、糖类含量33.24 mg/mL、蛋白质含量0.8730 mg/mL、木质素含量0.2701 mg/mL。

超滤膜分离工业生产装置:内装ZCB-4021 中空纤维超滤膜，有效膜面积2.5 m2。

1.2 实验方法

秸秆酶解液经过膜组件分离后，低聚木糖进入到透过液中，蛋白质和木质素被截留在膜的内侧，达到分离纯化的目的。检测原液和透过液中低聚木糖、蛋白质和木质素的浓度来分析超滤分离纯化的效果，考察料液浓度、操作压力、操作温度和pH 值各单因素对低聚木糖纯化效果的影响。以此为基础，根据Box-Behnken 的中心组合原理，以低聚木糖的透过率为响应值对提取条件进行优化。

试验水平如表1 所示。每次试验重复3 次，结果以平均值表示，数据处理采用Excel 和DPS7.05 统计软件。

表1 Box-Behnken 设计响应面实验因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design response surface experiment

1． 3 分析方法

可溶性固形物含量的测定，使用阿贝折光仪法;低聚木糖的测定，苯酚-硫酸法;还原糖的测定，3，5-二硝基水杨酸法;蛋白质含量的测定，考马斯亮蓝法;木质素的测定，硫酸沉淀称重法。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液浓度对低聚木糖纯化的影响

15℃、0.18 MPa、pH 7.0 下，考察不同料液浓度时的超滤分离效果(图1)。随着料液浓度增加，低聚木糖的透过率有所减小，蛋白和木质素去除率缓慢增大。因为料液浓度越大，溶液黏度增大溶质间的作用力增加，浓差极化现象越严重［12］，大分子蛋白和木质素透过膜的阻力越大，导致其截留率增大。

图1 不同料液浓度对蛋白质和木质素去除率及低聚木糖透过率的影响Fig.1 Influence of different feed concentration on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.2 操作压力对低聚木糖纯化的影响

控制料液浓度2.25° Brix、操作温度15℃、pH7.0，考察不同操作压力下的超滤分离效果(图2)。图2 显示蛋白和木质素的去除率随操作压力升高先增大后稍减小，低聚木糖的透过率随操作压力升高逐渐升高。这是因为压力增大一定值之后，膜的压密效应就会明显，膜孔变得越小，木聚糖酶分子质量大于20 ku、木质素分子质量为5 ～20 ku，故其截留率增大。而由于低聚木糖分子质量较小在500 ～1 000，所以影响很小［13］。?

图2 不同压力对蛋白质和木质素去除率及低聚木糖透过率的影响Fig.2 Influence of different operating pressure on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.3 操作温度对低聚木糖纯化的影响

2.25 °Brix、0.18 MPa、pH 7.0 下，考察温度对超滤分离效果的影响(图3)。温度升高，蛋白和木质素的去除率反而有所降低。这是由于温度上升后，溶质的扩散系数和迁移系数都增大，相应地，分子质量大的蛋白和木质素透过膜的几率也会增大。但是低聚木糖因为分子质量小，随温度升高变化不太明显，透过率维持在90.0% ～91.0%。

图3 不同操作温度对蛋白质和木质素去除率及低聚木糖的透过率影响Fig.3 Influence of different temperature on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.1.4 pH 值对低聚木糖纯化的影响

料液pH 值对蛋白质在溶剂中的荷电性、溶解性及分子构型都有影响。2.25°Brix、0.18MPa、25℃下，考察pH 对超滤分离效果的影响(图4)，与肖光耀等人［11］的研究结果相符合。料液pH 值接近蛋白质等电点时，以游离态的悬浮状态存在，透过阻力较大，截留率较高，大分子的木质素更多地被截留。低聚木糖的透过率以pH 5 时最小，为88.6%，中性条件下膜的透过性能最好，其值最高为89.7%。

图4 不同pH 对蛋白质和木质素去除率及低聚木糖的透过率影响Fig.4 Influence of different pH on protein rejection，xylogen rejection and XOS transmittance

2.2 Box-Behnken 模型优化工艺参数

2.2.1 低聚木糖超滤纯化模型的建立

根据单因素实验所得到的范围，以Design-Expert software 8.0.6.1 为辅助软件，选用Box-Behnken，进行四因素三水平共29 次试验(其中5 个中心点)的响应面分析［14］。这29 个点分别为:零点重复试验5 次，用以估计实验误差，24 个析因点分析各因素的变化。

表2 中蛋白质和木质素的去除率均维持在64.9% ～69.7%，蛋白质和木质素在原液中含量仅为3.3%，对分离效果的影响不大，故以低聚木糖的透过率为响应值进行最优化，结果见表3，并得二阶多项式回归模型［15］:

Y=91.78 －0.57A+0.36B－0.033C+0.50D+0.025AB+0.050AC－0.050AD－0.18BC－0.025BD+0.025CD－0.49A2+0.014B2－0.15C2－2.47D2

表2 响应面实验数据Table 2 The results of response surface experiment

表3 回归模型方差分析和方程系数的显著性检验结果Table 3 Variance analysis and significance equation coefficient of regression model

表3 中因素B 和A2 的P 值小于0.0500，表明该2 个因素是显著的，其他因素对试验结果干扰小。A，D，D2因素的P值＜0.000 1，是极显著的模型项，其因素范围需严格控制。当P值＞0.100 0 时表明该模型项是不显著的、干扰性大，因此其他项C、AB、AC、AD、BC、BD、CD、B2、C2是不显著项。失拟性的F值“0.63”意味着失拟性不显著，模型响应稳定。模型F 值为45.76、复相关系数R2(0.986 6)＞0.900 0，说明该模型显著、准确度高，模型能很好拟合试验数据，适用于本工艺条件的预测。

2.2.2 最佳工艺条件的响应面优化

响应面优化中各交互因素的等高线图如下。组图可评价分析任何俩因素对超滤纯化秸秆木聚糖酶解液总糖透过率的影响，并从中确定最佳因素条件。

图5 ～图7 中相应的弯曲曲面变化明显，交互作用显著，符合单因素实验的规律。图8 ～图9 显示料液浓度与操作压力、反应温度与操作压力、料液浓度与反应温度的响应面接近一个平面，交互作用不显著，与表3 中P值的判断一致。

Box-Behnken 模型响应面优化结果为:料液浓度1.97°Bx、操作压力0.20 MPa、反应温度26.02℃、pH值7.20，此时的低聚木糖的透过率为92.43%。响应软件得出各因素对总糖透过率的影响大小依次为:料液浓度、pH 值、操作压力、操作温度。考虑实际操作的因素要求，选择料液浓度为2.24°Bx、操作压力0.18 MPa、反应温度25℃、pH 值7，进行三次平行试验，低聚木糖的透过率分别为92.21%、91.19%、93.33%，最大偏移值为1.34%，与模型预测结果接近。

图5 操作压力与pH 值对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.5 Effects contour of operating pressure and pH on XOS transmittance

3 结论

(1)采用工业化超滤膜分离装置，以秸秆酶解液为原料，通过探索料液浓度、操作压力、操作温度、pH等关键工艺参数对蛋白和木质素去除率、低聚木糖的透过率的影响，得到秸秆酶解液超滤分离纯化过程中各单因素的影响规律，确定工艺条件范围为料液浓度2.00 ～2.37°Brix、操作压力0.18 ～0.22MPa、操作温度25 ～30℃、pH 值7。

图6 反应温度与pH 值对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.6 Effects contour of reaction temperature and pH on XOS transmittance

图7 料液浓度与pH 值对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.7 Effects contour of material liquid concentration and pH on XOS transmittance

图8 料液浓度与操作压力对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.8 Effects contour of material liquid concentrationand operating pressure on XOS transmittance

(2)利用Design-Expert software 8.0.6.1 为辅助软件，选用Box-Behnken 模型对实验条件进行优化，并且拟合二阶多项式回归模型将实验因素和实验结果函数化。通过对响应面等高线分析得到因素影响的强弱性依次为:料液浓度、pH 值、操作压力和操作温度。结合实际生产情况得到最优化工艺条件为料液浓度2.24°Brix、操作压力0.18 MPa、温度25℃、pH7，此时低聚木糖的透过率为92.1%，蛋白去除率67.9%，木质素去除率67.8%。现场实验与模型预测值一致，模型预测正确，最佳工艺条件合理。

图9 操作压力与反应温度对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.9 Effects contour of operating pressure and reaction temperature on XOS transmittance

图10 料液浓度与反应温度对低聚木糖的透过率的影响等高线Fig.10 Effects contour of material liquid concentrationand reaction temperature on XOS transmittance

(3)采用超滤法生产工艺分离纯化秸秆酶解液可行。与传统纯化方法相比，该法操作简单、能耗低、无二次污染，只需控制好浓度、压力等生产条件即可，具有广阔的应用前景和发展潜力。

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