微波辅助提取梵净山阳荷多糖的工艺优化*

陈仕学，沈家国，陈波，王大忠，张廷海

(铜仁学院生物科学与化学系，贵州 铜仁，554300)

阳荷(Zingiber strioatum)，又名洋姜、山姜、野山姜等，属于姜科姜属多年生草本植物。阳荷是一种营养价值很高、食药同源的膳食纤维蔬菜，富含蛋白质、氨基酸和丰富的膳食纤维多糖类物质［1］。其多糖具有极其重要的生理功能，如降血脂、延缓衰老、抗肿瘤等功效。目前对阳荷的研究主要有色素和蛋白质的提取研究，而对阳荷多糖的提取研究未见报道，原因是多糖的结构组成非常复杂，提取分离十分困难，所以选择一种合适的提取分离方法对阳荷多糖的研究具有重大意义［2］。本研究采用微波法辅助提取阳荷多糖，为进一步开发利用本地野生阳荷及后续研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料:野生阳荷，将采于梵净山附近林中的野生阳荷，洗净，切碎，晒干，置于60℃烘箱干燥，室温密封保存备用。

试剂:NaOH 固体，天津市大茂化学试剂厂;Cu-SO4，广东汕头市西陇化工厂;无水乙醇、95%乙醇，天津市富宇精细化工有限公司;蒽酮 国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖 天津市恒兴化学试剂制造有限公司;盐酸、浓硫酸、遵义师范学院化工试剂厂，以上试剂均为国产分析纯;水为二重蒸馏水。

仪器:T6 新世纪型紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司;MM823EC8-PS(X)型美的微波炉，佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司;101-3 型电热鼓风干燥箱，北京科伟永兴仪器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司;AR124CN 型电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司;80-2 型离心沉淀机，江苏金坛市中大仪器厂。

1.2 实验方法［3－4］

选材→烘干→脱脂→烘干→粉碎→过筛→加浸提剂搅匀→微波处理→过滤→滤液浓缩→除蛋白→离心取滤液→脱色→无水乙醇沉淀→静置12h→过滤→干燥

将已烘干的阳荷干品在常温下用5 倍体积的乙酸乙酯浸泡3h，用蒸馏水清洗残留的有机溶剂至样品无味，将其置于60℃的烘箱内烘干，得脱脂样品。在脱脂样品中加入浸提剂，适当条件下微波处理，将样品过滤，取滤液水浴浓缩至1/2 体积。用Sevag［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1］试剂除蛋白，离心去沉淀，向滤液加入4%H2O2溶液除色素。并加入4倍体积无水乙醇室温静置12h，将沉淀物置于70℃干燥箱中干燥，平行实验3 次，求平均值，计算多糖的提取率。

数据处理和图表绘制用Microsoft Excel2003 和SPSS16.0 进行进行，平行实验3 次，取平均值。

1.2.1 样品溶液的制备

准确称取经过干燥的阳荷(粉碎后过20 目筛)1.000 0 g，置于100 mL 锥形瓶中，加入一定量的蒸馏水，用微波法对其进行多糖提取，在常温下过滤，取滤液1 mL，加入5 mL 无水乙醇，摇匀，静置24 h，3 000 r/min 离心20 min，去上清液，滤渣用2 mol/L H2SO4溶液溶解后，加水定容至10 mL，摇匀，备用。

1.2.2 葡萄糖标准溶液和蒽酮-硫酸试剂的配制

葡萄糖标准溶液配制:精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖标准品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，摇匀，得0.1 mg/mL 的葡萄糖样品溶液，备用。

2 mol/L H2SO4溶液:准确移取111.11 mL 浓H2SO4溶液，定容至1 L，用于溶解多糖。

蒽酮-硫酸溶液配制:精确称取蒽酮粉末0.100 0 g 加入100 mL 的锥形瓶中，加入浓度为80% 的H2SO4，定容至100 mL，备用。

1.2.3 浸提剂的确定

分别用蒸馏水、不同浓度的乙醇溶液作为阳荷多糖的浸提剂，用紫外分光光度计测出吸光度，得出最佳浸提剂。

1.2.4 微波提取条件的优化［5－6］

分别以最佳浸提剂为溶剂，对不同料液比、浸提时间和功率进行单因素试验，并对料液比、时间和功率采用L9(33)进行正交试验，通过正交分析，得出微波提取阳荷多糖的最佳提取工艺参数。

2 结果与分析［7 －10］

2.1 葡萄糖标准曲线的绘制

分别从葡萄糖样品溶液中精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于试管中，加蒸馏水定容至2 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液6 mL。置于沸水中加热15 min 后取出，放入冰浴中冷却，以相应的空白试剂作对照，在波长为625 nm 下，以吸光度A 为纵坐标，葡萄糖含量c(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线(见图1)，得回归方程为:A=0.0364C+0.0624，R2=0.9992。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Glucose standard curve

由此可以得出多糖提取率的计算公式:

提取率/% =［(A－0.062 4)/0.036 4 ×10 ×V/m/1000］×100

式中:A为吸光度;m为称取阳荷质量，g;V为浸提液体积，mL。

2.2 浸提剂的确定

用不同体积分数的乙醇和蒸馏水为浸提剂提取阳荷多糖，结果见表1。

表1 不同浸提剂对提取率的影响Table 1 Influence of different extracting agent on the extraction ratio

由表1 可知，本实验用70%的乙醇作为提取阳荷多糖的最佳浸提剂。

2.3 单因素实验

2.3.1 提取时间的影响

准确称取过20 目筛干燥阳荷粉1.000 0 g，料液比为1∶20(g∶mL)，中火(440 W)下分别提取1、2、3、4、5 min。按1.2.1 中样品溶液的制备及2.1 中标准曲线制作的方法分别实验，测其吸光度，并代入回归方程中求其多糖提取率，实验结果见图2。

图2 作用时间对提取率的影响Fig.2 Influence of different acting time on the extraction ratio

由图2 可知，随着提取时间的延长，阳荷中多糖的提取率逐渐增加，在4 min 时多糖的提取率达到最大，超过4 min 后，多糖提取率随时间的延长逐渐下降。可能是多糖的浸出率达到了动态平衡，多糖氧化分解速度逐渐增加所致，故选择4 min 作为进一步优化提取条件的浸提时间。

2.3.2 料液比的影响

准确称取1.000 0 g 阳荷粉，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)，中火(440 W)作用下浸提4 min，按1.2.1 中样品溶液的制备及2.1 中标准曲线的制作方法分别实验，测其吸光度，并代入回归方程中求其多糖提取率，实验结果见图3。

图3 料液比对提取率的影响Fig.3 Influence of different solid-liquid ratio on the extraction ratio

由图3 可知，料液比为1∶30(g∶mL)之内时，多糖提取率逐渐增加，料液比超过1∶30(g/mL)后，提取率逐渐下降，这可能是多糖的溶出率已达到平衡，过多的溶剂造成多糖的损失。故选择1∶30(g∶mL)作为进一步优化提取条件的最佳料液比。

2.3.3 微波功率的影响

准确称取1.000 0 g 阳荷粉，料液比1 ∶30(g/mL)，微波功率分别为低火(136 W)、中低火(264 W)、中火(440 W)、中高火(616 W)、高火(800 W)下浸提4 min。按1.2.1 中样品溶液的制备及2.1 中标准曲线的制作方法分别实验，测其吸光度，并代入回归方程中求其多糖提取率，结果见图4。

图4 微波功率对提取率的影响Fig.4 Influence of different microwave power on the extraction ratio

由图4 可知，随着提取功率的增加，阳荷多糖的提取率随之增加，当提取功率为中低火时达到最大，之后随提取功率的增加而逐渐下降。可能是由于功率的增加造成多糖氧化分解所致，故选择提取功率为中低火作为进一步优化提取条件的最佳功率。

2.4 正交试验

为了确定在提取过程中各因素的影响大小，本研究对微波法提取阳荷多糖的3 个单因素即提取时间(A)、料液比(B)、微波功率(C)进行正交试验，并以多糖提取率作为提取工艺的判断依据。根据设置选用L9(33)正交表，试验方案设计及结果见表2 和表3。

表2 正交试验因素水平表Table 2 The factor levels of the orthogonal test

表3 正交试验结果及极差分析Table 3 The results of orthogonal test and range analysis

由表3 极差分析结果显示，3 个因素对阳荷多糖提取率的影响依次为:提取时间＞微波功率＞料液比。正交优化条件为A1B1C2，即提取时间为3 min，料液比为1∶20(g∶mL)，微波功率为中火(264 W)。

2.5 验证性实验［11］

为了考察上述工艺的稳定性，按微波法提取阳荷多糖的最佳工艺条件A1B1C2，即提取时间为3 min，料液比为1∶20(g∶mL)，提取功率为中火的条件下分别进行重复性试验5 次，分别测定其多糖提取率，计算其RSD ，结果见表4。

表4 验证实验结果Table 4 The verification testing results

由表4 可知，在此工艺条件下，多糖平均提取率为13.01%，优于正交实验中任何一组，RSD 为0.44%，说明该工艺稳定。

2.7 三种提取方法比较［12］

同法采用常规浸提法得出阳荷多糖的最佳提取条件为:料液比为1∶40(g∶mL)，提取时间为80 min，提取温度为90℃，阳荷多糖的提取率平均值为5.05%;超声波辅助法最佳提取条件料液比为1∶30(g∶mL)，提取时间为30 min，提取温度为70℃，在此条件下阳荷多糖的提取率平均值为8.18%。3 种提取方法比较见表5。

表5 常规提取、超声波与微波提取法效率比较Table 5 The comparation of the extraction efficiency among the conventional method，ultrasonic method and the microwave-assisted method

由表5 可知，微波辅助提取法具有提取时间短、耗材少、提取效率高等优点，故可用于工业上大规模生产。

3 结论

本试验采用微波法、常温浸提和超声波法提取阳荷多糖，对阳荷多糖的提取工艺进行了优化。微波辅助提取的最佳工艺条件为:浸提时间3 min，料液比1∶20(g∶mL)，微波功率为中火，多糖的提取率为13.01%，且稳定性高;采用常规浸提法的最佳提取工艺条件为:料液比1∶40(g∶mL)，浸提时间80 min，浸提温度90℃，多糖的提取率平均值为5.05%;超声提取的工艺条件:料液比1∶30(g∶mL)，浸提温度70℃，浸提时间30 min，超声功率100 W，多糖提取率为8.18%。采用微波法辅助提取阳荷多糖具有操作简单，时间短，提取率高，能耗低等优点，可以广泛用于工业上多糖的生产。

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