臭鳜鱼的风味物质及风味活性物质分析*

李春萍，吴佳佳，李燕，王雪峰，赵巧灵，徐坤华，戴志远，2，顾天生

1(浙江工商大学水产品加工研究所，浙江 杭州，310012)

2(浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室，浙江 杭州，310012)

3(嘉兴市荷花水产养殖有限公司，浙江 嘉兴，314000)

臭鳜鱼，又名腌鲜鳜鱼，是传统淡水鱼发酵制品之一，至今已有200 多年历史。这种“风味鳜鱼”闻起来臭，吃起来香，既保持了鳜鱼的本味原汁，肉质又醇厚入味。其制作步骤主要是将新鲜鳜鱼(Siniperca chuatsi)在适宜温度下腌浸，经数天腌制发酵后，其风味品质发生改变，鱼体散发出似臭非臭的的气味，但洗净烹调后非但没有臭味，反而散发出诱人的鱼香且味道鲜美。臭鳜鱼因其似臭非臭、香鲜透骨、鱼肉酥烂的特点，成为徽式风味名菜的代表菜品。

近年来国内外诸多学者从原料品质、工艺参数、微生物、贮存条件等因素对发酵鱼制品风味品质进行研究。Giri 等对不同原料鱼制备的味噌进行分析，发现大部分为常见的风味成分［1］，同样Jiang 等研究发现，鳀鱼和黑鱼制备的传统鱼露的主要风味物质相似，仅在含量比例上存在差异［2］。在腌制加工中，盐和微生物的添加对风味起到重要作用，Jonsdottir 等发现一次性加盐、分批加盐和预先加盐腌制使脂质和蛋白质经不同途径降解，其中预先加盐产品的风味、色泽最佳［3］，Fukami、江津津等通过添加微生物，从而改善了发酵鱼露的风味品质［4－5］。

鱼露、腊鱼、糟鱼等中国传统发酵水产制品的风味品质已有学者进行了相关研究［5－7］，但关于臭鳜鱼的研究报道仅局限于工艺参数［8］。本试验以臭鳜鱼为原料，采用固相微萃取结合气相色谱质谱联用技术对其风味品质进行研究，以鉴定其挥发性风味化合物并进一步探讨赋予其独特气味的风味活性物质。

1 材料与方法

1.1 材料

臭鳜鱼制品，采自安徽省黄山味美佳工贸有限公司，由该公司直接冰藏运送至实验室，立即清洗取肉后，将鱼肉绞碎均匀且分装，于－20℃冰藏待试验分析。

1.2 试剂

甲硫醇，十六醛和柠檬烯:(Sigma-Aldrich，Shanghai，China)，1-丁醇，1-辛烯-3-醇，香樟醇，乙酸，丁酸，十四酸，己醛，庚醛，辛醛，壬醛，三甲胺(Aladdin Reagent Database Inc. Shanghai，China)，二甲基三硫，十六酸，吲哚，2，4，6-三甲基吡啶(J＆K Scientific Ltd. Shanghai，China)。所用试剂均为色谱纯。

1.3 主要仪器设备

固相微萃取装置:100 μm 聚二甲基硅氧烷(PDMS)涂层萃取头，75 μm 碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)涂层萃取头，50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂层萃取头(Supelco Inc．，Bellefonte，PA，USA);GCMS:Trace GC Ultra 气相色谱与DSQ Ⅱ质谱联用仪(Thermo Fisher Scientific Co. ，Austin，TX，USA)。

1.4 试验方法

1.4.1 内标物( Internal Standard，IS) 的配制及优化

2，4，6-三甲基吡啶(IS)溶于去离子水中，配制成浓度为100 mg/kg 的标准溶液。因臭鳜鱼中挥发性风味物质的浓度不明，故本试验通过添加不同浓度的内标物进行优化。参考相关文献［1，9］，对IS 浓度优化范围为:1，5，10 (μg IS/g 样品)。

1.4.2 固相微萃取条件优化

SPME 参数主要为萃取头、样品量、萃取温度、萃取时间、解析时间等，这些参数的选择对挥发性风味物质的萃取效果有重要影响。本试验参考相关文献报道的实验条件，在样品量:5 g;萃取温度:60℃;萃取时间:30 min;解析时间4min 的实验基础条件下，逐步对萃取条件优化，优化范围为萃取头:100 μm PDMS，75 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS;样品量(g):3，5 和8;萃取温度(℃):40，50，55，60，65，70，75;萃取时间(min):20，30，40，50;解析时间(min):2，4，6，8。

1.4.3 GC-MS 条件

气相色谱条件:色谱柱为TR-35MS，0.25 mm i. d. ×30 m×0.25 μm (Thermo Fisher Scientific Co. ，Massachusetts，USA)。进样口温度:250 ℃，程序升温:初始温度30 ℃，保持2 min，以4.0 ℃ /min 升至92 ℃，保持2 min，以5.0 ℃ /min 升至200 ℃，再以6.0 ℃ /min 升至240 ℃，保持6min。载气(He)流速为0.8 mL/min，不分流模式进样。

质谱条件:电子轰击(EI)离子源;电子能量70 eV;传输线温度250 ℃;离子源温度250 ℃;质谱扫描范围33 ～450 m/z。

1.4.4 定性方法

试验数据通过Xcalibur 系统软件完成。挥发性成分通过NIST 2. 0 和Mainlib Library 谱库确认定性，要求正反匹配度(SI/RSI)均大于800 (最大值为1 000)。在与样品相同的GC-MS 条件下，分析C5～C25的正构烷烃，进一步计算挥发性风味物质的保留指数(RI)。结合谱库检索(MS)和RI 值比对的结果，综合对风味物质鉴定。

RI 计算公式为:

式中:Tx，待测物的保留时间;Tn，与待测物含相同碳原子数的正构烷烃的保留时间;Tn +1，比待测物所含碳原子数多一个的正构烷烃的保留时间;n，待测物所含的碳原子数。

1.4.5 定量方法

试验通过内标法对挥发性风味物质进行定量分析，在优化的内标物浓度下，根据内标物与风味物质积峰面积的比例，计算化合物的浓度。其公式为:

1.4.6 风味活性物质的鉴定

根据1.4.4 及1.4.5 中鉴定及定量后的挥发性风味物质，参考相关文献中测定的嗅觉阈值，确定风味活性物质，计算气味活度值(OAV)，并通过相应标准品对风味活性物质进行进一步质谱鉴定。

OAV 计算公式为:

其中:OAV 值大于1 视为对整体风味有重要贡献，其值越大，风味贡献越大。

1.5 数据处理

所测样品平行3 次，通过Excel 系统处理数据，其挥发性风味化合物的浓度以平均值±标准偏差表示。通过Origin 8.0 数据处理软件进行制图。

2 结果与分析

2.1 内标物浓度优化

对内标物浓度的优化结果如图1 所示。根据峰面积和峰个数进行选择，当浓度为5 ng/g 时，获得最多的峰个数，且峰面积较大。故最终选择内标物浓度为5 ng/g 进行风味物质的分析。

图1 内标物浓度优化图Fig. 1 Optimization of the concentration of IS

2.2 固相微萃取条件优化

2.2.1 萃取头选择

萃取头对挥发性风味物质的吸附性是根据相似相溶原理，不同型号的萃取头对风味物质的萃取效率不同，从而仪器的分析灵敏度不同。故选择合适的萃取头型号是SPME 分析的关键步骤。本试验比较PDMS、CAR/PDMS 和DVB/CAR/PDMS 3 种萃取头对臭鳜鱼挥发性风味物质的萃取效果。萃取结果见图2 所示。

图2 萃取头优化图Fig 2 Optimization of the SPME fibers

根据图2 显示结果，从萃取总面积和萃取峰个数进行优化，发现PDMS 萃取头的萃取效果明显比较差，因该萃取头适合于小分子及非极性挥发性物质。CAR/PDMS 萃取头适合分析分子质量小、沸点低、极性中等的物质，其萃取峰面积较DVB/CAR/PDMS 有所增大，但峰个数相对较少。DVB/CAR/PDMS 适用的物质分子量范围更加广阔，且极性适应性更好，对于非极性以及中等极性的物质均有较好的萃取效果。故综合峰面积和峰个数，选择DVB/CAR/PDMS 萃取头提取臭鳜鱼风味物质。

2.2.2 样品量选择

样品瓶顶空体积的大小对萃取效率及检测灵敏度有重要影响。本试验对样品量为3，5 和8 g 进行优化，其结果如图3 所示。从3 g 增加到5 g，峰面积和个数明显增加，但增加至8 g，效果不明显。同时根据相关研究报道［10］，本试验选择最佳取样量为5 g。

图3 样品量优化图Fig 3.Optimization of the sample amounts

2.2.3 萃取温度选择

通过加热顶空瓶可以加速分子运动，促进挥发性风味物质的扩散，有利于吸附，但同时也会降低吸附分析组分的能力［11］。本试验萃取温度优化结果如图4 所示。随着温度的逐渐升高，萃取峰面积和峰个数增加明显，70℃峰个数达到最大值，随着温度的升高峰个数有所下降。综合试验结果，选择70℃为最佳萃取温度。

图4 萃取温度优化图Fig．4 Optimization of the extraction temperature

2.2.4 萃取时间选择

在萃取的初始阶段，待分析组分很容易富集到萃取纤维头上，合理延长萃取时间可提高萃取效率。正如图5 所示，萃取时间从20 min 延长到50 min，萃取峰面积得到有效增大，且峰个数也有所增加。综合考虑，萃取40 min 的峰面积和峰个数最为理想，且相比50 min 既缩短时间又获得更多的峰个数，因此选取40 min 为最佳萃取时间。

图5 萃取时间优化图Fig 5.Optimization of the extraction time

2.2.5 解析时间选择

将吸附在萃取纤维头上的化合物在高温的进样口热解析，通过载气进入色谱柱内进一步分离。解析时间的设定决定了化合物能否得到完全解析，从而影响最终的分析结果。本试验对解析时间优化结果如图6 所示。解析4 min 能获得最大的峰面积和峰个数，随着解析时间的进一步增大，峰面积和个数反而下降。故4 min 能有效的确保吸附的化合物解析，达到最优的效率。

2.3 臭鳜鱼中风味化合物的鉴定及分析

通过谱库检索和保留指数两种鉴定方法，臭鳜鱼产品中一共鉴定出45 种挥发性风味物质，如表1 所示。在鉴定的化合物中，包括4 种烷烃类，8 种醇类，2 种酮类，6 种醛类，8 种酸类，3 种酯类，5 种含硫化合物，2 种含氮化合物以及7 种芳香类化合物，如表2所示。其中醇类化合物占总挥发性风味物质的62.60%，为挥发性成分的最主要部分。在臭鳜鱼产品中，含量由高到低依次为醇类、酸类、醛类、含氮、含硫以及芳香类化合物，酮类及酯类所占比例较小。

图6 解析时间优化图Fig.6 Optimization of the desorption time

表1 臭鳜鱼挥发性化合物的鉴定结果Table 1 Identification results of the volatile compounds of stinky mandarin fish

续表1

高含量的醇类物质在广式腊肠中也有报道，并且以乙醇为主［12］。臭鳜鱼的醇类物质中，以芳樟醇含量最高，占总醇类的96.27%，占总挥发性化合物的60.27%，是最主要的挥发性化合物。芳樟醇在水产品中的报导较少，因其不是鱼体本身所含有的，而是由于添加调料等途径进入鱼体，成为加工后鱼制品的新风味成分。在臭鳜鱼腌制加工中，会添加一些调味料，如花椒、姜等，有研究发现木姜、花椒精油等调味品中芳樟醇含量较高［13］，因此芳樟醇可能由这些调味料经渗透作用，溶入鱼体并最终成为臭鳜鱼的重要风味物质。同样经烟熏渗透作用，香糟鲤鱼风味物质中发现芳樟醇，并且在醇类中含量最高［14］。正丁醇和1-辛烯-3-醇是鱼体中比较常见的醇类［1，9］，其中1-辛烯-3-醇可作为金丝鱼、白鲢鱼等的特征香气成分［15－16］，Giri 等研究发现，1-辛烯-3-醇等支链醇类由酵母发酵中的两条途径生成:分别为碳水化合物的EMP 途径和氨基酸的Ehrlich 途径［1］。

本研究中酸类物质含量仅次于醇类，其中丁酸的含量最高，它与乙酸均广泛存在于发酵产品中。乙酸是乳酸菌发酵体系中常见的酸，也可由丙氨酸降解和脂质氧化产生［1，2，17］。臭鳜鱼中十四酸、十六酸和油酸的含量均较高，这些长链酸在香糟鲤鱼和鱼露中均有发现［2，14］。Variet 等发现挥发性十六醛可经氧化途径生成十六酸［18］，与本试验在臭鳜鱼风味物质中检测到较高浓度的十六醛，同时检测到高含量的十六酸相符。

臭鳜鱼风味物质中共检测到6 种醛类，己醛、壬醛和十六醛含量比较高。研究发现脂肪族醛类如己醛、庚醛、壬醛、十六醛等主要是通过脂质降解和氧化产生［19］。Variet 等发现十六醛是新鲜鲑鱼风味成分中的第二高含量化合物，但其阈值比较高，对整体的风味贡献不大［18］。在臭鳜鱼中，醛类物质占总风味物质的8.23%，其种类和含量对产品的风味品质有重要作用。

臭鳜鱼是经过腌制发酵的产品，因而挥发性风味物质中检测到品种较多、浓度较大的含氮、含硫物质。其中甲硫醇、二甲基二硫、二甲基三硫、二甲基四硫等含硫化合物在发酵水产制品中普遍存在，且有研究发现是低盐鱼酱油的主要挥发性成分，对整体风味品质起到重要影响［20－22］。根据已有研究报道，挥发性含硫化合物形成途径为:蛋氨酸生成二甲基硫醚和甲硫醇，从而甲硫醇可进一步氧化形成二甲基二硫和二甲基三硫化合物，该途径中甲硫醇是形成含硫化合物的关键点，同时其本身也是非常重要的风味物质［23］。在臭鳜鱼中检测到两种高含量的含氮化合物，分别为三甲胺和吲哚。其中三甲胺在水产制品中常见报道，如Giri 等在发酵鱼酱中发现，三甲胺是最主要的含氮化合物，且对产品整体的鱼腥味起作用［1］。吲哚通常和腐败、霉变等风味品质联系在一起，是发酵制品中常见的一种风味物质，其生成和发酵过程中微生物等条件密切相关，是产品质量的重要指标［2，20－21，24］。

臭鳜鱼产品中共检测到7 种芳香类化合物，占总风味物质的4.89%(表2)。其中最主要的是苯酚，其在鱼露、烟熏鲤鱼等产品中均有发现，且在鱼露中含量较高，其含量与原料和加工工艺紧密相关［1，14］。

臭鳜鱼中共检测到4 种烷烃类:十四烷、十六烷、十七烷和2，4，6-三甲基-十四烷，占总风味物质的4.92%，烷烃类嗅觉阈值普遍较高，故对整体风味作用不明显;在臭鳜鱼风味物质中检测到胡椒酮、花椒素以及3 种酯类物质，在总风味物质中所占比例较低。

表2 臭鳜鱼9 类挥发性化合物的浓度及含量Table 2 The concentrations and armounts of the nine classes of the volatile compounds

2.4 臭鳜鱼风味活性物质的鉴定及分析

对臭鳜鱼中鉴定出的45 种风味物质进行风味活性分析，通过参考已有文献报道并进一步采用标准品鉴定，共得出13 种风味活性物质，其气味活度值见表3。在臭鳜鱼产品中，OAV 值最大的是丁酸，如表1所示丁酸是含量最高的酸，且其阈值较低，仅0.2 ng/kg，具有浓烈的奶油味、干酪味及哈喇黄油味。第二主要风味活性物质是三甲胺，该物质具有腐败鱼肉的气味，在臭鳜鱼中其浓度为530.83 ng/kg，阈值为0.1 ng/kg［26］，故OAV 值很大，是非常重要的风味活性物质。芳樟醇源于发酵过程中添加的调味料，经渗透进入鱼体，形成非常高的浓度，且气味活度值高达662.94。因此芳樟醇赋予了臭鳜鱼新的类似花香的、植物香气的、柑橘类的香味，从而改善了臭鳜鱼整体的风味品质。1-辛烯-3-醇、二甲基二硫、己醛、庚醛、辛醛、壬醛、乙酸都具有较高的气味活度值(表3)，对臭鳜鱼整体的风味起到重要的作用。吲哚、正丁醇和2-甲基丁酸的风味活度相对较小，其中最小为正丁醇，仅1.025。这13 种风味活性物质共同作用，使鱼腥味、腐败味、硫味、洋葱味、哈喇味、奶油味、脂香、花香、柑橘味等风味特征结合，赋予臭鳜鱼全新的风味。尤其是丁酸、三甲胺等，使其风味不同于新鲜鳜鱼;芳樟醇这特殊的醇类使臭鳜鱼的风味品质有别于其他发酵水产制品。

3 结论

通过优化SPME 萃取参数，最终设定内标物浓度为5 ppm，采用DVB/CAR/PDMS 萃取头在70 ℃对5 g 样品萃取40 min，经4 min 解析后，进行气质联用仪分析臭鳜鱼风味物质。通过标准谱库和RI 两种方式进行挥发性化合物的比对，一共在臭鳜鱼中鉴定得45 种风味物质，将其划分为9 类。各类化合物所占比例为:醇类含量最高，62.60%，酸类8.23%，烷烃类4.92%，芳香类4.89%，含氮化合物4.58%，含硫化合物3.34%，酮类1.25%以及酯类0.57%。

表3 臭鳜鱼13 种风味活性化合物及其气味活度值Table 3 13 odor-active compounds and OAV values

通过计算气味活度值，在臭鳜鱼的45 种风味物质中鉴定得13 种风味活性物质，其中丁酸OAV 值最高，其次为三甲胺、芳樟醇、壬醛、乙酸、1-辛烯-3-醇、辛醛、二甲基二硫、己醛、庚醛、2-甲基丁酸、吲哚以及正丁醇。其中OAV 值较高的芳樟醇赋予臭鳜鱼类似花香、植物香等新的风味特征。同时结合具有奶油味、哈喇味、腐败味、鱼腥味的丁酸、三甲胺、醛类以及其它风味活性物质形成臭鳜鱼整体风味品质，使其明显区别于新鲜鳜鱼以及其他发酵水产制品，整体散发出似臭非臭，闻着臭，吃着香的独特风味。

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