植物多糖的水解及水解物结构的研究进展*

李丹丹，宋烨，吴茂玉，朱风涛，于滨，马晓燕

1(齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东 济南，250353)

2(中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东 济南，250014)

植物多糖是植物细胞代谢产生的聚合度超过10的多聚糖，是除蛋白质和核酸以外的又一类重要的生物大分子［1］。多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、提高机体免疫力、降血糖血脂等功效［2］，在保健食品、畜牧生产、医药、化妆品等领域有广阔的应用前景［3］。20 世纪70 年代以来的研究发现，植物多糖水解产物也具有多方面的生理作用，如增强免疫、抗肿瘤、降血糖、降血压、增强机体免疫等［4］，尤其是其水解产物分子量小、渗透性好的优点，弥补了大分子多糖溶解性差、生物利用率低的不足［5］。因此，研究植物多糖水解及水解产物的结构对充分发挥植物多糖功效有重大作用。

1 植物多糖的水解方法

多糖是由10 个以上的单糖通过糖苷键组成的高分子化合物，可以水解产生一系列的中间产物，完全水解得到单糖［6］。目前水解多糖的方法主要有化学法、物理法和生物法(如表1 所示)。

表1 植物多糖水解方法的特点Table1 The characteristics of the methods of plant polysaccharides hydrolysis

1.1 化学法

通过在多糖溶液中加入化学解聚剂，使多糖分子的糖苷键断裂或发生分子重排，从而生成单糖或低聚糖。目前常用的化学法有酸法、氧化法和亚硝酸盐法。

1.1.1 酸法水解

多糖在酸性溶液中不稳定、糖苷键易断裂，最终可形成不同聚合度的水解物，是植物多糖水解的传统方法。目前，HCl、H2SO4是水解中最常用的酸，反应过程受底物浓度、酸浓度、酸添加量、水解时间和温度的影响，随着酸浓度和温度的升高，水解速度逐渐加快［7－8］。缪月秋等［9］采用HCl 水解葫芦巴中性多糖，分别以低聚糖的产量和分子量大小为指标优化水解工艺条件，发现水解条件直接影响水解结果，得出最优条件下低聚糖得率为43.97%、分子质量约为300 ～750Da，得到大幅下降;何艳丽等［10］探讨了H2SO4浓度和水解时间对大米草多糖水解物清除羟自由基能力的影响，发现大米草多糖水解物具有比未水解的大米草多糖更强的清除能力，最佳水解条件下可以达到85.7%。上述2 种酸均为强酸，水解活动较剧烈，多糖水解度较高，但水解产物比较复杂，分子量分布宽，均一性较差。因此有人考虑选用弱酸水解多糖，Jia 等［11］用85% H3PO4水解壳聚糖，随着反应时间的延长水解速率逐渐降低，室温下处理35 d 后壳聚糖的黏均分子质量从214 kDa 降到71 kDa，壳聚糖分子质量降到20 ～37 kDa，水溶性部分含量随着分子量的降低有所增加，多糖产物分子量均一性好、水溶性增强。

此外，还可采用无水氟化氢［12］、乙酸［13］、三氟乙酸(TFA)［14］等水解植物多糖。但氟化氢水解条件较苛刻实验室中应用较少，而TFA 在水解结束后经旋转蒸发便可除去，避免了碱中和的步骤，在实验中应用比较广泛。

1.1.2 氧化法

氧化剂的活性基团能夺取多糖β-l，4-糖苷键1位或4 位上的H 原子，使多糖的C—O—C 键发生断裂，从而产生分子质量较小的寡糖，是近年来研究较多的水解植物多糖的方法［15］，常用的氧化剂主要是H2O2。Zhang 等［16］用VC和H2O2相结合的方法对缘管浒苔多糖进行水解，制备出3 种水解物进行体外抗氧化实验，结果表明3 种水解产物都有不同程度的抗氧化性，且当水解物浓度超过0.7 mg/mL 时，羟基自由基的清除能力都高于未水解多糖的活性。楼陈钰等［17］在弱酸性条件下用H2O2水解壳聚糖，发现温度的升高、时间的延长以及H2O2用量的增加都有利于壳聚糖分子量的降低。此外，Matijia 等［18］用O2、N2对普鲁兰多糖进行氧化处理后的水解速率明显高于未处理组，说明水解前对多糖进行氧化处理有助于多糖的水解。

此法水解植物多糖成本低、速度快、产品分子量低且分布窄，水解物无毒、易实现大规模工业化生产。研究发现混合氧化剂的效果要比单一氧化剂好［19］，因此在试验中除了只用H2O2氧化之外，还可混入其它化学物质以提高降解率，如酸、NaBO3［20］、ClO2、Cl2等。

1.1.3 亚硝酸盐法

酸性条件下亚硝酸盐使多糖发生重氮化反应，脱去一分子N2引起缩环反应，使糖苷键断裂从而实现多糖水解［21］，反应过程中可以通过控制亚硝酸盐的添加量和反应时间来控制水解物的分子量。试验中常用的亚硝酸盐为NaNO2，上官国莲等［22］用NaNO2法制备低聚壳聚糖，并对其理化性质进行了检测，探讨了水解条件对产物特征黏度和黏均分子质量的影响，结果表明当质量分数10% NaNO2的用量为0.6 mL、反应温度为40℃、反应时间为30 min、乙酸体积分数为1%时得到的壳聚糖水解产物的特征黏度最低，即黏均分子质量最小为1.95 kDa，由F 检验结果可知各水解条件对壳聚糖黏均分子质量的影响大小为:时间＞温度＞NaNO2用量＞乙酸浓度，即反应时间对壳聚糖水解物的黏均分子质量和特征黏度影响最大。

1.2 物理法

物理法是指在一定物理条件下，通过断裂易断裂的糖苷键来减小多糖的分子量，从而达到水解多糖的目的。常用的方法有超声波法、辐射法和微波辅助法等。

1.2.1 超声波法

在超声波作用下，分子高速运动产生的剪切力能够打断大分子糖苷键，此外超声波特有的空化作用也能使聚合物降解，从而使大分子聚合物解聚。Chen等［23］研究了超声波辅助酸法水解壳聚糖以及对水解物分子质量分布的影响，认为低温稀溶液条件下壳聚糖水解速度较快，随着超声时间的延长水解度逐渐增加，聚合度不断减小，因此超声波处理植物多糖可以降低其分子质量。Zhu 等［24］研究了超声水解枸杞多糖，发现随着底物浓度和pH 值的增加水解速率降低，随着温度的升高水解速率加快，水解物的黏度随着反应的进行逐渐减小，分子质量也不断降低。邓永智等［25］将超声波法和TFA 法水解海藻多糖进行比较，发现超声波法水解多糖的效率要高。由此可见，超声波法对降解大分子多糖有一定的作用，也是目前使用较多的物理方法之一，但该法所得产物的得率较低，且生产成本较高，要实现大规模工业化生产还需进一步研究。

1.2.2 辐射法

与酸法水解相比，辐射法制备小分子糖无环境污染、生产可控性好。近年来，许多人也做过相关方面的研究且取得了一定进展。康斌等［26］用60Co-γ 辐射源对壳聚糖进行辐照，发现随着辐射剂量的增加，壳聚糖水解产物的分子量急剧减少，分子链断裂数Cd值随之升高;李治等［27］用60Co 辐射源分别在大气和真空条件下照射壳聚糖，可得到一系列低聚合度的壳聚糖，随着辐射剂量的增加，壳聚糖的分子质量明显降低，当辐射剂量达到250 kGy 时，大气环境下壳聚糖的分子质量从274 kDa 下降到24 kDa，而真空中的下降到20 kDa。由此可见，辐射法对大分子糖的解聚有很大作用，加之此法成本低、反应易控制、无污染、产品品质高、不影响降解产物的生物相容性，为辐射法的应用奠定了基础，但γ 射线辐射容易引起一些交联和岐化反应，还需进行深入研究。

此外，紫外、可见光和红外光照射也对多糖有一定的解聚作用。Viviana 等［28］发现在用紫外-可见光度计测壳聚糖的降解程度时，在紫外光照射下壳聚糖的降解程度有所提高，且当辐照波长小于360nm 时，降解反应较明显，但降解过程中生成羰基的使产品有褐变现象。

1.2.3 微波辅助法

微波作为电磁波，具有很好的穿透性，放射出的能量能一定程度上影响多糖分子的运动。当微波辐射作用时，分子就会处于一种快速振动的状态，分子间化学键的强度得以减弱，从而降低反应活化能，加速了分解反应的进程。舒任庚等［29］以半乳糖量为指标研究微波水解青钱柳多糖的影响因素，结果显示水解温度120℃，TFA 浓度2 mol/L，水解时间20 min时，半乳糖的质量分数为10.23%，与单纯使用TFA相比大大缩短了水解时间，提高水解效率。李鹏程等［30］将聚合度为3 ～150、相对分子质量在600 ～30 000Da之间的壳聚糖加入到含NaCl、KCl 或CaCl2的电解质稀酸溶液中，以480 ～800W 的微波辐射3 ～12 min，冷却至室温后用2 mol/L 的NaOH 溶液中和得淡黄色絮状沉淀，在60℃下烘干，粉碎，即得甲壳低聚糖化合物。此方法能够降低能耗，减少污染，节省时间和原料，但由于微波升温过快，存在单体挥发，反应不充分等不足还需进行深入研究。

1.3 酶法水解

酶的特异性、高效性、温和性以及可调性使其在实验中得到广泛应用。多糖水解过程中，某些酶能作用于多糖的糖苷键使其断裂从而达到水解多糖的目的。酶活力受温度、时间、pH 和底物浓度等因素的影响，所以在实验过程中要控制好实验条件才能充分发挥酶的催化作用。水解植物多糖常用的酶主要有:纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、壳聚糖酶、脂肪酶等。

黄永春等［31］研究超声波辅助α-淀粉酶对壳聚糖的降解情况，超声波的高频率振荡使分子高速运动，大大增加了酶和底物的接触机会，加速反应的进行。Yashida 等［32］发现壳聚糖酶能一定程度地水解壳聚糖，但在反应过程中需要有乙酰基的协助催化，在乙酰度较低的情况下，随着乙酰度的降低酶活增高，且此时甲壳低聚糖的收率较高。Adsul［33］等采用纤维素酶和木糖酶混合水解甘蔗渣多糖，研究了不同比例的混合酶在不同温度下对甘蔗渣的水解程度，以水解微晶纤维素为对照，发现微晶纤维素的最大水解率为70%，而甘蔗渣多糖的水解率可高达95%，此时2 种酶的最佳混合比列为1∶1。袁素霞等［34］用β-甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖并跟踪水解物在酶解历程中的分子质量变化，发现随着反应的进行，产物的分子质量分布逐渐向低分子质量区域转化。Muzzarelli等［35］对小麦胚芽脂肪酶水解壳聚糖的作用进行了水解，发现当脂肪酶浓度在4.5 ×10－3～0.9 g/L 时，水解速度与酶浓度呈对数关系，最后所得水解物的分子质量由原来的700 kDa 左右降低到13 kDa，黏度也有所降低。

综上所述，制备较低分子量多糖的方法有很多且各有优缺点，根据试验要求采用不同的方法是试验的关键。但目前对多糖水解的研究仅局限于实验室，且研究重点多停留在影响多糖水解的因素上，对其降解机理以及降解产物的进一步研究有待缺乏，如何把实验转化成实际生产也是今后研究的一个方向。

2 多糖水解产物的结构分析

随着多糖水解反应的发生，可以得到不同分子量大小的水解物，水溶性也不同程度得到改善，在某些生理活动方面也表现出了优势。结构决定功能，为进一步探讨这些生理活性产生的机制，对水解物结构的鉴定也成了研究的一个重点。

2.1 多糖水解物的单糖组成分析

多糖的水解物一般是低聚合度的寡糖，在测定其单糖组成成分时一般采用层析、气相、液相色谱的方法，与标准单糖的图谱对照得出单糖成分。孙元琳等［36］分别采用酸和酶对当归多糖(ASP)进行部分水解，气相色谱分析结果表明水解物中的单糖组成为鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)和半乳糖醛酸(GalA)。不同程度的酸水解后，水解物中单糖组成成分相同但含量有所差别。ASP3 分别经0.05、0.2、0.5 mol/L TFA 水解后，水解物组分随着酸水解程度的增加，GalA 和Rha 含量相应增加，而Ara、Gal、Man 和Glc 含量逐渐下降。汉丽萍等［37］研究了高山红景天多糖的部分酸水解产物的制备，并对其水解产物分别进行了纸层析和气相色谱分析，纸层析结果检出为GalA，与气相色谱分析结果完全一致。有研究发现糖醛酸含量与抗氧化活性之间有正相关关系，随着糖醛酸含量的增加，抗氧化性逐渐增强［38］，所以水解物中检测出的GalA 为其抗氧化活性奠定基础。

2.2 多糖水解物的分子量测定

多糖水解的主要目的是降低多糖的分子量，因此分子量减小是衡量多糖水解成功的重要标志。闫景坤等［39］研究了酸水解冬虫夏草胞外多糖的分子质量变化规律，凝胶色谱法分析酸水解物中多糖分子质量变化发现随着时间的延长，水解产物的分子质量分布总体上表现为高分子质量(﹥30 kDa)的多糖含量逐渐减少，而低分子质量(3 kDa)的多糖含量逐渐增多且最终维持在此水平。王凌等［40］采用超声辅助H2O2-VC体系诱导产生的自由基降解海藻多糖，将水解物纯化分离后得到2 种产品并经高效液相凝胶渗透色谱分析得出海藻多糖和两种降解产品的分子质量分别为2 595.08、386.96、54.99 kD，认为多糖降解后分子量有较大程度的减小。吕宁等［41］采用酶法对麦冬多糖进行水解，水解物用SephadexG-100 柱进行分离得到3 种新组分，并分别检测其分子质量分别为32 452、9 231、1 354Da，与分子质量为48 347Da 的原多糖相比分子质量有一定程度的减小。分子质量的减小在一定程度上可以增加物质的水溶性，增大溶解度，为充分发挥其生物活性提供了基础保证。

2.3 光谱分析

糖类化合物结构分析中常用的光谱技术有红外、紫外、核磁共振等。孙元琳等［36］利用酸和酶对当归多糖部分水解，红外光谱分析表明ASP3 的水解物中Rha 含量较原始多糖有所升高，1 260、1 100 和1 050 cm－1处的特征吸收说明当归多糖水解物中含有GalA;1 075 和1 040 cm－1处的特征吸收说明水解物中含有鼠李糖-半乳糖醛酸聚糖，与单糖组成分析的结果一致。康斌等［26］用γ 辐射降解壳聚糖并用红外、紫外光谱等手段进行了表征分析，结果显示随着辐射剂量的增加，3 450 cm－1处的O—H 吸收峰不断增大，说明在降解过程中有—OH 生成，且随着反应的进行不断增加，1 650 cm－1处的C=O 吸收峰随剂量的增加不断增加，这也与水解物具有的抗氧化有很大的关系。汉丽萍等［37］在对高山红景天多糖水解物进行红外光谱分析，图谱显示1 740 ～1 600 、1 440 ～1 395 和1 320 cm－1处有羧基吸收峰，与单糖组成分析结果一致，进一步证明红景天多糖水解物中存在GalA。

康斌等［26］用γ 辐射法成功制备了一系列小分子水溶性壳聚糖，并用紫外-可见光谱对水解产物进行表征分析，据吸收图谱发现降解产物在265 nm 处出现了一个新的吸收峰，且峰的强度随着辐射剂量的增加而增强，推测是C =O 的吸收峰，与随后的红外分析结果相一致。孙元琳等［14］对当归多糖ASP3 进行部分酸水解和酶水解产物进行核磁共振(NMR)光谱分析以推测ASP3 的结构，综合一维和二维NMR 推测ASP3 是一种果胶多糖，半乳糖醛酸和鼠李糖醛酸聚糖位于多糖分子的主链，并由α-(1-5)-阿拉伯聚糖通过α-(1-3)连接与β-(1-6)-半乳聚糖末端聚合形成阿拉伯半乳聚糖，部分T-Galp 的O2位被甲基取代为2-O-Me-β-Galp。

3 结论

目前对植物多糖水解方面的研究取得了极大的进展，体外抗氧化试验也验证水解所得低分子质量糖有较高的抗氧化性，针对水解方法、水解条件的优化做了深入研究，对获得低分子质量寡糖有很大的促进作用。但是对植物多糖的断链机理、水解物的结构与活性之间关系的研究还有欠缺，结合其他学科知识将多糖水解扩大生产并应用到实际生活也是下一步研究的方向，因此对植物多糖的研究还有待深入。

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