新疆伊犁牧区发酵乳制品中酵母菌的分离和多样性分析*

李宇辉，王俊钢，刘成江，郭安民，李开雄

1(新疆农垦科学院 农产品加工研究所，新疆 石河子，832000)2(石河子大学食品学院，新疆 石河子，832000)

奶疙瘩是新疆哈萨克族和蒙古族牧民经过酸凝手工自制的奶酪，营养丰富，且经过成熟发酵后生成的肽、胨、氨基酸等极易被人体消化吸收，其中部分脂肪被降解为不饱和脂肪酸，有助于降低人体的血清胆固醇，有利于预防心血管疾病［1］。

近年来工业化发酵乳制品的生产、消费逐渐向牧区渗透，牧区部分牧民已开始放弃传统发酵乳制品的生产工艺和方法。长此以往，将逐渐取代新疆特殊气候环境、特殊工艺条件下形成的丰富多样的发酵乳制品微生物资源，使发酵乳制品的产品和菌种单一化。奶疙瘩中的主要发酵菌是产酸凝乳的乳酸菌［2］，在成熟过程中酵母菌可以促进微生物之间的共生作用、CO2的形成、提高特殊风味和香气方面起着重要的作用［3］。因此对经过几千年驯化的具有优良性状的酵母菌需加强有效保护，防止微生物种质资源的流失。

本研究主要对伊犁牧区的奶疙瘩中的酵母菌进行分离，并对其分布和种类的多样性进行分析，旨在为发掘和保护新疆特有的酵母菌种质资源和乳制品中优良酵母菌的再利用提供基础数据。

1 材料

1.1 原料

新疆民族传统奶酪:采自那拉提牧区、唐布拉牧区，托里县，布尔津等地。

1.2 仪器设备

全温振荡器HZQ-Q 型，哈尔滨东联电子科技有限责任公司;数显不锈钢电热培养箱 HPX-9272MBE，上海跃进医疗器械厂;PCR 扩增仪050-810 Tgradient 48，Biometra Tgradient;净化工作台SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司。

1.3 培养基

菌种分离、使用PDA (Potato Dextrose Agar)培养基，对于样品中酵母菌的振荡培养、液体培养、分离效果较好。

纯化保存使用平板和斜面培养基为YPD(Yeast extract Peptone Dextrose)培养基。

生理生化试验使用氮源基础培养基、碳源基础培养基、无维生素基础培养基、糖发酵基础培养基，Gorodkowa 培养基和脲酶培养基［4］。

2 试验方法

2.1 酵母菌种分离、纯化、保存

(1)取1 g 样品，室温下溶于10 mL 无菌水中，置于25 ℃的培养箱中，培养40 min。

(2)将样品溶液以3%的体积比接种于PDA 液体培养基中，在25 ℃培养箱中培养72 h。

(3)将初次接种的PDA 液体培养物采取稀释平板法涂于YPD 培养基进行分离。

(4)将接种后的YPD 培养基于25 ℃下培养，待长出菌落后，选择具有酵母菌典型菌落特征的单一菌落进行划线分离，经划线分离2 ～3 次后，用显微镜镜检为纯种后，分别置于YPD 斜面培养基上保存待用。

2.3 酵母菌的理化性质测定

糖发酵实验、同化实验、维生素生长需要实验、抗性实验、温度生长实验、尿素水解实验、耐渗透压实验等。

2.4 26S rDNA 酵母菌的鉴定

DNA 的提取方法参照文献引物序列:正向引物NL-1:5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3';反向引物NL-4:5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'［5］。

PCR 扩增:用引物NL1 和NL4 PCR 扩增供试菌体26S rDNA 近5’端的D1/D2 区域，按下述反应条件进行36 个循环:94 ℃，1 min;53 ℃，1 min;72℃，1 min 20 s。所得产物纯化后由北京奥科测序。

3 结果与分析

经过菌种的分离、纯化，共得到33 株酵母菌:从伊犁尼勒克县唐布拉牧区采集的5 份发酵乳制品中得到11 株Ym1 －Ym11;从伊犁新源县那拉提牧区的5 份样品中得到9 株Yn1 －Yn9;从托里县采集的5份样品中得到酵母菌6 株Yt1 －Yt6;从布尔津县采集的5 份样品中得到酵母菌7 株Yb1 －Yb7。

3.1 理化鉴定结果

由表1 可以得出，33 株酵母菌通过生理生化试验，根据酵母菌的特征与鉴定手册，将33 株酵母菌经过检索归为5 个种，分别是发酵型毕赤氏酵母(Pichia fermentans)12 株，膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)1 株，马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)8 株，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)9 株，假丝酵母(Candida zeylanoides)3 株。

表1 新疆伊犁牧区采集乳制品中分离酵母菌的生理特性Table 1 Physiological characteristics of the yeasts isolated from Cheese collected in Xinjiang Yili

注:1. Pichia fermentans;2. Pichia membranifaciens;3. Kluyveromyces marxianus;4. Saccharomyces cerevisiae;5. Candida zeylanoides。

3.2 酵母菌26S rDNA 鉴定

26S rDNA D1/D2 区序列在GenBank 数据库中进行同源序列检索，比较新鉴定菌株与已知酵母菌相应序列的同源性，根据同源序列搜索结果，从库中获得与新鉴定菌种相关属、种的26S rDNA D1/D2 区序列。为充分显示新鉴定菌株与已知酵母菌的亲缘关系及其分类地位，将所有序列用ClustalX 1.81 软件进行匹配排列Neighbor-Joining 分析构建系统发育树。

包括11 株实验菌及相关菌种模式株在内的26S rDNAD1/D2 区序列构建系统发育树(见图1)。从图1 可以看出，Ym6、Ym9 、Ym11 同属于K.marxianus同源性达到100%，Ym2、Ym10 经鉴定属于S.cerevisiae，Ym1、Ym3、Ym4、Ym5 、Ym7 属于P.fermentans同源性在99%以上。唐布拉牧区奶酪中的优势酵母菌为P.fermentans占总分离菌株数的45.5%。

从图2 的发育树中不难看出Yn1、Yn9 属于P.membranifaciens，但Yn1 的生理生化鉴定结果为P.fermentans。Yn2、Yn3、Yn6、Yn8 同属于P.fermentans，Yn4 属于S.cerevisiae同源性达到100%，Yn5、Yn7 同属于Kluyveromyces属的Kluyveromyces marxianus同源性达到100%。那拉提牧区奶酪中的优势酵母菌为P.fermentans占总分离菌株数的45.5%。

图1 唐布拉牧区酵母菌株的发育树Figure1 Phyogenetic tree of yeast strains in Tangbula pastoral area

布尔津县牧区的样品中分离得到的Yb2、Yb4、Yb6 同属于S.cerevisiae(如图3)其同源性达到100%，Yb5、Yb7 同属于Kluyveromyces marxianus并达到100%的同源性，Yb3 属于Candida zeylanoides，此种酵母在发酵乳制品中并不多见，Yb1 与P.fermentansMg-1 和Pichia kluyveriS148 的相似度都很高，结合生理生化鉴定结果将其归为P.fermentans。布尔津县牧区奶酪中的优势酵母菌为S.Cerevisiae，占总分离菌株数的42.9%。

由图4 可以得出Yt1、Yt4、Yt6 同属于S.cerevisiae，Yt5 属于K.marxianus，Yt2 属于C.zeylanoides同源性达到100%，Yt3 属于P.fermentans同源性达到98%以上。托里县牧区奶酪中的优势酵母菌为S.cerevisiae占总分离菌株数的50%。

3.3 伊犁牧区发酵乳制品中酵母菌的分布特点

从伊犁牧区分离到酵母菌的数量见表2。由表2可知，33 株分离菌株被定为4 属5 种，唐布拉牧区的发酵奶制品中P.fermentans为优势菌(45.5%)，那拉提牧区的发酵奶制品中优势菌也是P.fermentans(45.5%)，而托里县牧区和布尔津县牧区发酵奶制品中优势菌为S.cerevisiae。4 处不同采样点都分离出K.marxianus和S.cerevisiae。对于P.fermentans的分布唐布拉和那拉提牧区较多，而托里县和布尔津县较少。

图2 那拉提牧区酵母菌株的发育树Fig.2 Phyogenetic tree of yeast strains in Nalati pastoral area

图3 布尔津地区酵母菌株的发育树Fig．3 Phyogenetic tree of yeast strains in Buerjin country

图4 托里地区酵母菌株的发育树Fig．4 Phyogenetic tree of yeast strains in Tuoli country

表2 伊犁4 个采样点酵母菌分离株数量Table 2 Numbers of strains belonging to different species isolated from four places in Yili

4 讨论

对于Yn1 的生理生化鉴定结果为P.fermentans，26S rDNA D1/D2 区序列分析结果中Yn1 与Pichia membranifaciensIFO10731 的相似度更大，综合分析后将Yn1 归为P.membranifaciens，其余的生理生化鉴定结果与26S rDNA D1/D2 区序列分析结果一致。从试验中可以得出26S rDNA D1/D2 区序列分析结果准确度高，分析简便，但其对于基因数据库的依赖性较强，有时需要其他方法作为补充和校对。因此对于酵母菌的鉴定来说，传统生理生化方法与分子生物学技术相结合，鉴定结果更为准确［6］。

很多酵母菌作为乳制品中自发产生的微生物群落存在，例如酿酒酵母就总是与其他酵母一起，自发产生于蓝纹干酪和软干酪中［7－8］。此外当酿酒酵母作为发酵剂使用时可在干酪中进一步形成柔软的质地和高浓度的芳香物质［9］。研究表明，酵母菌参与乳制品中碳水化合物的发酵，并能生产芳香族化合物，同时还可能会刺激乳酸菌的生长，抑制产毒素霉菌的生长，改善乳制品的营养价值，有些菌株还可能有益生菌特性［10］。

本试验中在4 个地区的采样点分离得到的酵母菌的种类和数量有一定差异，具有明显的地域性。传统发酵的乳制品的微生物的数量和种类受制作方法、温度、气候条件、酸凝乳剂的添加量、当时发酵成熟的环境等因素的影响［11］。唐布拉牧区和那拉提牧区所处直线距离52 km，海拔相近均在1 100 m 左右，两个牧区都有河流流经，水源丰富(唐布拉牧区位于喀什河上游，那拉提牧区位于伊犁河谷东端)，属于温带大陆性半干旱气候，相对湿润。托里县位于准噶尔盆地西北缘断山区，平均海拔1 450 m 左右，气候相对于那拉提和唐布拉牧区干燥、多风，与那拉提牧区直线相距298 km;布尔津县位于阿尔泰山南麓、额尔齐斯河畔、平均海拔1 390 m 左右，与那拉提牧区直线相距538 km，属于温带大陆性寒凉气候，全年多季风。4 个地区属于两种不同的生态区域，都具有生物的广泛性和多样性，但种类上有所差异。当然对于本试验中唐布拉、那拉提牧区与托里县、布尔津县样品中优势菌种的不同，除了考虑气候、生态环境外，还需对制作方法、酸凝乳的添加量、制作季节、发酵环境等因素综合做进一步的研究。

5 结论

本研究从新疆伊犁牧区的4 个地区共采集到奶酪样品20 份，从中分离出33 株酵母菌。这些菌株经鉴定分别归为5 个种，其中P.fermentans11 株，P.membranaefaciens2 株，K.marxianus8 株，S.cerevisiae9 株，C.zeylanoides3 株。C.zeylanoides在唐布拉牧区、托里县和布尔津县的样品中均有出现，初步推断这两种气候差异对于C.zeylanoides的存在影响不大。研究表明，唐布拉牧区和那拉提牧区样品的优势菌株为发酵毕赤氏酵母(Pichia fermentans)，托里县和布尔津县样品中的优势菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae);马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是伊犁牧区奶酪样品中的共同菌株。

［1］ 尹丽娟，李宇辉，李开雄. 适合半硬质干酪生产的当地民族传统乳品中发酵剂的筛选［J］． 食品科技，2010(12):38 －41.

［2］ 朱小红，杨振泉，顾瑞霞，等. 新疆传统乳制品中优良乳酸菌的筛选及多菌株发酵剂的研究［J］． 食品与发酵工业，2008(12):30 －34.

［3］ 贺银凤. 传统发酵乳制品中乳酸菌和酵母菌的互作关系［J］． 中国乳品工业，2010(10):43 －45.

［4］ Barnett JA，Payne RW，Yarrow D. 酵母菌的特征与鉴定手册［M］． 胡瑞卿译. 青岛:青岛海洋大学出版社，1991:17 －55.

［5］ CletusP，Kurtzman，ChristieJ，Robnett.. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts fromanalysis of nuclear large subunit (26S)ribosomal DNA partial sequences［J］． Anton Leeuw，2008 (73):331 － 371.

［6］ 倪慧娟，包秋华，孙天松，等. 新疆地区酸马奶中酵母菌的鉴定及其生物多样性分析［J］． 微生物学报，2007，47(4):578 －582.

［7］ Beresford T P，Fitzsimons N A，Brennan N L，et a1. Recent advances in cheese microbiology［J］． Int Dairy J，2001(11):259 －274.

［8］ Hansen T K，Jakobsen M. Taxonomical and technological characteristics ofSaccharomycesspp.associated with blue veined cheese［J］． Int J Food Microbiol，2001，69(12):59－68.

［9］ Hansen T K，Vadder Tempel T，Cantor M D，et al.Saccharomyces cerevisiaeas a starter culture in Mycella［J］． Int J Food Microbiol，2001，69(12):101 －111.

［10］ Jespersen L. Occurrence and taxonomic characteristics of strains ofSaccharomyces cerevisiaepredominant in African indigenous fermented foods and beverages［J］． FEMS Yeast Res，2003，3(2):191 －200.

［11］ 卿蔓君，白梅，张勇，等. 西藏曲拉和云南乳饼中酵母菌的鉴定及其生物多样性［J］． 微生物学报，2010 50(9):1 141 －1 146.