L-苯丙氨酸抗噬菌体生产菌的选育和应用

周海岩，刘龙，堵国成，3，陈坚，3

1 (浙江工业大学生物工程研究所，浙江 杭州，310014)

2 (江南大学生物工程学院，江苏 无锡，214122)

3 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡，214122)

噬菌体是一类感染细菌或放线菌的特殊的病毒［1］。噬菌体污染现象在工业发酵生产中极其普遍，轻则使发酵周期延长、发酵产量降低，重则造成倒罐，不仅浪费时间、人力及物力，而且造成重大经济损失［2］。为解决噬菌体污染的问题，通常采用多方面综合治理的措施，即控制生产环境质量、化学防治及更换或轮流使用不同的生长菌株等方法。然而防治过程往往不够彻底，这是由于噬菌体分布极其广泛，凡是有细菌的地方就可能存在相应的噬菌体，而且噬菌体体积较小，一般的过滤装置难以将其完全除去。抗噬菌体生产菌株的选育可以从根本上解决这一问题，从而保证发酵过程连续、稳定地进行。

在大肠杆菌WSH-Z06 (pAP-B03)发酵生产L-苯丙氨酸(L-Phe)过程中，L-Phe 产量下降、菌体裂解、发酵产物提取困难等异常现象时有出现。经双层平板法检测证实，导致发酵异常的主要原因是噬菌体污染。为克服此问题，本研究进行了抗噬菌体并高产L-Phe 的菌株选育工作，考察了突变株在外源添加噬菌体条件下的发酵能力，并初步探讨了突变株的抗噬菌体机制，为L-Phe 的工业化生产提供了1 株发酵性能优良的菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒和噬菌体

大肠杆菌WSH-Z06 和质粒pAP-B03，由江南大学生物系统与生物加工实验室构建并保藏［3］。

噬菌体BP-1 分离于重组大肠杆菌WSH-Z06(pAP-B03)的L-Phe 异常发酵液，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2010054。

1.2 培养基

TY 培养基［4］(g/L):蛋白胨10，酵母膏5，葡萄糖1，NaCl 5，pH 7.0，用于噬菌体增殖;单层固体培养基中加琼脂2%，用于噬菌体的检测;双层固体培养基中上层加琼脂0.8%，下层加2%，用于噬菌体的分离和检测。

蛋白胨水［5］:蛋白胨10 g/L，蒸馏水配制，pH 7.0。

曙红亚甲基蓝琼脂培养基(EMB):蛋白胨10 g/L，乳糖10 g/L，KH2PO42 g/L，2%伊红Y 溶液20 mL，0.65%美蓝溶液10 mL，琼脂2%，pH 7.1，用于大肠杆菌的鉴定。

种子培养基、发酵培养基和流加培养基参照文献［3］。

1.3 噬菌体BP-1 的分离、纯化

1.3.1 噬菌体增殖液的制备

取感染了噬菌体的发酵液5 mL，接入50 mL TY培养基中，同时加入1 mL 培养至对数期的WSH-Z06菌液，于37℃、200 r/min 培养12 ～16 h，即为噬菌体增殖液。

1.3.2 噬菌体裂解液的制备

取噬菌体增殖液500 μL，加入到4.5 mL 蛋白胨水中;37℃、200 r/min 振荡培养4 ～6 h;60℃水浴中静置10 min 以诱导噬菌体的释放;37℃、200 r/min振荡培养2 ～3 h;加入10% (v/v)三氯甲烷，处理30 min (帮助噬菌体裂解细菌);8 000 r/min 离心5 min;取上清液，用0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌;置于4℃冰箱中保存备用。

1.3.3 噬菌体的分离、纯化

采用双层琼脂平板法［6］。将适当稀释的噬菌体裂解液100 μL、培养至对数期的WSH-Z06 菌悬液100 μL 加入到保温于45 ～50℃的TY 上层培养基中，振荡混匀，立即倒入预先准备好的下层培养基平板表面，凝固后置于37℃培养12 ～24 h，待平板上出现单个的噬菌斑，用接种针将噬菌体接入含有WSHZ06 的液体TY 中，37℃振荡培养12 ～16 h;按照1.3.2 所述的方法制备噬菌体裂解液，重复以上步骤，直至出现形态、大小特征基本一致的噬菌斑。

1.3.4 噬菌体效价的测定

对双层平板中出现的噬菌斑进行计数，将结果代入以下公式以计算噬菌体的效价:

式中，N为效价值(PFU/mL);Y为平均噬菌斑数/皿;V为取样量(mL);X为稀释倍数。

1.3.5 噬菌体的电镜观察

取一定量的异常发酵液或稀释后的噬菌体裂解液，与等量的2%磷酸钨钠混合染色5 ～10 min 后滴1 小滴在覆有弗姆瓦(Formvar)的铜网膜上，用干燥滤纸从侧面吸取染液，自然干燥后在透射电镜(H －7000，日本Hitachi 公司)下观察噬菌体的形态特征。

1.3.6 pH 和温度对噬菌体活性的影响

pH 对噬菌体活性的影响:参照文献［7］进行。将噬菌体裂解液分别加入到pH 为3、4、5、6、7、8 和9的蛋白胨水中，25℃水浴中静置2 h，以pH 7.0 的蛋白胨水逐级稀释，按照1.3.4 所述的方法测定噬菌体的活性。

温度对噬菌体活性的影响:参照文献［7］进行。将噬菌体裂解液分别置于50℃、60℃、70℃和80℃水浴中5 min、10 min、15 min 和20 min，之后立即置于冷水中至恒温，以蛋白胨水逐级稀释，按照1.3.4 所述的方法测定噬菌体的活性。

1.4 抗噬菌体、高产L-Phe 的重组大肠杆菌的筛选

1.4.1 WSH-Z06 的NTG 诱变处理

离心(10 000 r/min，5 min)、收集培养至对数期的WSH-Z06 菌体，用0.1 mol/L，pH 7.0 的磷酸钾缓冲液洗涤1 ～2 次，然后悬浮菌体。按照表1 的体积组成配制成菌悬液为10% (v/v)、NTG 终浓度分别为0.2、0.4、0.6 和0.8 mg/mL 的体系;于37℃、200 r/min 的摇床上振荡30 min;25℃、10 000 r/min 离心10 min，取菌体沉淀，用磷酸钾缓冲液洗涤3 次并制成菌悬液，37℃、200 r/min 中间培养4 ～6 h，适当稀释后涂布LB 平板，37℃下培养过夜。挑取不同形态、大小和颜色的单菌落，用无菌牙签分别点种在划有小格子的LB 平板上，37℃培养12 ～14 h，4℃保藏以待噬菌体抗性的检测。

表1 NTG 诱变体系的体积组成Table 1 Composition and concentration of NTG mutagesis system

1.4.2 抗噬菌体、高产L-Phe 的重组大肠杆菌突变株的筛选

初筛:采用单层平板法［4］。对平板上的单菌落逐一进行噬菌体抗性的检测，方法如下:挑取单菌落，与100 μL LB 培养基在TY 平板中混匀、涂布，在平板的4 个象限处分别滴加10 μL 噬菌体裂解液。静置10 ～20 min，置于37℃培养12 ～24 h，观察噬菌斑的出现。对4 个象限中均没有噬菌斑的菌株进行传代培养，并对每1 代菌株以同样的方法进行噬菌体抗性检验。对于传代20 次以后仍没有出现噬菌斑的菌株进一步以TY 双层平板法对其进行验证，挑选出抗性菌株，作为初筛目的菌株，保藏，以备复筛。

复筛:将L-Phe 生产质粒pAP-B03 转化入初筛目的菌中，检测重组菌摇瓶发酵生产L-Phe 的能力，以WSH-Z06 (pAP-B03)为对照，挑选出在菌体生长和L-Phe 产量方面均没有显著降低的突变株，作为复筛目的菌株，用于L-Phe 的发酵生产。

1.5 感受态的制备及质粒的转化方法

参照《分子克隆实验指南》第三版［8］。

1.6 培养方法

大肠杆菌种子培养、摇瓶发酵和3 L 发酵罐发酵按照文献［3］进行。添加噬菌体的发酵则在培养初始时向培养基中添加1% (v/v)、1 ×1010PFU/mL 的噬菌体裂解液。

1.7 发酵参数检测方法

菌体浓度(DCW)、葡萄糖浓度(Glc)和L-Phe产量测定方法按照文献［3］进行。

2 结果与讨论

2.1 噬菌体BP-1 的分离、纯化和形态特征

WSH-Z06 (pAP-B03)发酵生产L-Phe 的异常发酵液中感染的噬菌体，在TY 双层平板上呈现形态、大小较一致的噬菌斑，后经反复纯化证实感染的是同一种噬菌体，将其命名为BP-1。其噬菌斑呈全透明状，形态为圆形，直径3 mm 左右［图1(a)］。

经透射电镜观察发现，BP-1 呈蝌蚪状，有一个多面体立体对称的头部，直径约45 nm，有一长尾，尾长约125 nm，宽6 ～8 nm，无尾丝［图1(b)］，初步判断属于长尾噬菌体科，λ 噬菌体属。

2.2 pH 和温度对BP-1 活性的影响

2.2.1 pH 对BP-1 活性的影响

BP-1 在不同pH 的蛋白胨水中处理后，其活性因pH 的不同而表现出明显的变化。由图2(a)看出，BP-1 的存活率与pH 之间的关系呈现钟形分布;最适pH 范围为5 ～8，在该范围内，BP-1 具有80%以上的存活率;在该范围之外，随着pH 的降低或增加，BP-1的存活率明显下降，在pH 为2 和11 时，接近于0。

图1 噬菌体BP-1 的噬菌斑(a)和电镜下的形态(箭头所指处)(×19 000)(b)Fig. 1 Plaques of bacteriophage BP-1 (a)and its transmission electron micrograph (b)

图2 不同pH (a)和温度对噬菌体BP-1 (b)活力的影响Fig. 2 Effect of pH (a)and temperature (b)on bacteriophage BP-1 viability

2.2.2 温度对BP-1 活性的影响

通过测定不同温度下BP-1 的活性，发现其在50℃和60℃下较稳定，处理20 min 之后，活力仍保持在80%以上;而在70℃和80℃下活力随着时间的延长而显著下降，80℃处理20 min 之后，BP-1 的存活率几乎降至0［图2(b)］，说明噬菌体BP-1 对60℃以上的温度比较敏感。

2.3 WSH-Z06 的NTG 诱变处理结果

经过4 个不同浓度(0.2、0.4、0.6 和0.8 mg/mL)的NTG 处理后，挑选出416 株菌进行BP-1 抗性的检验，初步得到了6 株突变菌，分别命名为BR-42、BR-55、BR-95、BR-130、BR-183 和BR-184。

对6 株突变菌进行遗传稳定性检验，淘汰了4 株不稳定菌株;对剩下的BR-42 和BR-130 进行镜检、EMB 平板验证等确证了这2 株菌是遗传稳定的抗BP-1 的大肠杆菌(见图3)。

2.4 抗BP-1 的重组菌摇瓶发酵生产L-Phe

对突变菌BR-42 和BR-130 进行质粒pAP-B03的转化和摇瓶发酵培养，以WSH-Z06 (pAP-B03)为对照，结果见表2。

表2 不同的重组大肠杆菌发酵生产L-Phe 的能力比较Table 2 Comparison of L-Phe production by different recombinant E. coli strains

图3 NTG 诱变后的突变菌BR-42 和BR-130 对BP-1 的抗性检测Fig.3 The examination of bacteriophage BP-1-resistance of E. coli mutants after NTG treatment

发酵结束时，对照菌的DCW 和L-Phe 产量分别为7.05 g/L 和4.47 g/L，而BR-130 (pAP-B03)的分别为3.67 g/L 和2.11 g/L，与对照菌相比，分别降低了48%和53%，这可能是由于NTG 对细胞的生理造成的损坏所导致的生长、代谢缓慢;而BR-42 (pAPB03)的DCW (7.18 g/L)和L-Phe 产量(4.24 g/L)均与对照无显著差别，因此，选择BR-42 (pAP-B03)进行以后的发酵实验。

2.5 在添加噬菌体BP-1 条件下的摇瓶发酵

为了考察E.coliBR-42 (pAP-B03)在BP-1 存在条件下生产L-Phe 的能力，在500 mL 摇瓶水平上分别对BR-42 (pAP-B03)和WSH-Z06 (pAP-B03)进行了2 组发酵实验，其中一组是正常发酵培养，另一组是在发酵初始时向培养基中添加了1% (v/v)、效价为1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，结果见表3。在BP-1 存在的条件下，WSH-Z06 (pAP-B03)的生长和生产L-Phe 的能力大大降低，分别是正常发酵时的40%和26%，发酵结束时的pH 值较正常发酵时高19%;而BR-42 (pAP-B03)的DCW、L-Phe 产量以及终pH 值在有BP-1 存在的情况下和正常发酵时均无明显差别，表明BR-42 (pAP-B03)的生长和发酵能力不受噬菌体BP-1 的影响。

表3 添加噬菌体BP-1 条件下的两组大肠杆菌摇瓶发酵参数比较Table 3 L-Phe production by E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)and E. coli BR-42 (pAP-B03)in the presence of bacteriophage BP-1 in shake flasks

2.6 在添加噬菌体BP-1 条件下的3-L 发酵罐发酵

为了进一步确证BR-42 (pAP-B03)对BP-1 的抗性，在3-L 发酵罐上分别对BR-42 (pAP-B03)和WSH-Z06 (pAP-B03)进行了分批补料培养，并在发酵初始时添加1% (v/v)、效价为1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，结果见图4 和图5。发酵2 h 后，WSHZ06 (pAP-B03)DCW 逐渐下降;8 h 时菌体形态变为椭圆和圆形，长度只有正常时的1/4 左右，并伴有大量菌体裂解、致使形态模糊［图4(b)］;14 h 时发酵液变澄清，显微镜下观察只有极少量的椭圆形菌体，菌体几乎完全被BP-1 裂解［图4(c)］，被迫下罐;而BR-42 (pAP-B03)菌体生长和产L-Phe 能力几乎没有受到BP-1 的影响［图4(d)、(e)、(f)和图5(b)］，最大DCW 为15.41 g/L，发酵52 h 时L-Phe 产量达到34.87 g/L，该水平与初始菌株WSH-Z06 (pAPB03)正常发酵时(35.38 g/L)［3］无显著差别。

2.7 WSH-Z06 (pAP-B03)对噬菌体的抗性机制

噬菌体对微生物细胞的侵染经历了吸附、DNA的注入、DNA 的复制和衣壳蛋白的装配以及成熟噬菌体的释放等4 个基本过程。抑制或阻止任一过程都可以使宿主菌具有抵御噬菌体的能力［9］。经检测，突变株WSH-Z06 对实验室保藏的其它λ 噬菌体同样不敏感，而且该菌株不能利用麦芽糖为碳源进行生长。据报道，麦芽糖转运蛋白LamB 是λ 噬菌体尾丝蛋白与宿主菌的外膜蛋白特异性结合的受体［10－11］，由此可初步推断WSH-Z06 对噬菌体的抗性机制可能与麦芽糖转运蛋白LamB 的突变有关，即LamB 的失活阻止了噬菌体对宿主菌的吸附。分子水平和基因水平的噬菌体抗性机理还有待于进一步的研究。

图4 WSH-Z06 (pAP-B03)和BR-42 (pAP-B03)在添加BP-1 的条件下的菌体形态Fig.4 The cellular morphous of E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)and BR-42 (pAP-B03)during the fermentation process in the presence of bacteriophage BP-1

3 结论

(1)利用双层平板法从WSH-Z06 (pAP-B03)生产L-Phe 的异常发酵液中分离、纯化到一株噬菌体BP-1，初步判断其属于长尾噬菌体科，λ 噬菌体属。

(2)采用NTG 诱变处理WSH-Z06，检测单菌落对BP-1 的敏感性和遗传稳定性，又经镜检、EMB 平板验证初筛出2 株抗噬菌体BP-1 的突变菌BR-42 和BR-130。将生产L-Phe 的质粒pAP-B03 转化到突变菌中，进行摇瓶发酵复筛，获得了菌体生长和L-Phe生产能力均无显著降低的BR-42 (pAP-B03)。

(3)向培养基中添加1% (v/v)、效价为1 ×1010PFU/mL 的BP-1 裂解液，BR-42 (pAP-B03)最大DCW 达到15.41 g/L，在52 h 时，L-Phe 产量达到34.87 g/L，该水平与WSH-Z06 (pAP-B03)正常发酵时无显著差别，说明BR-42 (pAP-B03)是1 株可以抗噬菌体BP-1 并能高产L-Phe 的优良菌株，可以代替WSH-Z06 (pAP-B03)应用于L-Phe 的工业生产中。

图5 添加BP-1 条件下的E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)(a)和E. coli BR-42 (pAP-B03)(b)的发酵过程曲线Fig. 5 L-Phe production by E. coli WSH-Z06 (pAP-B03)(a)and E. coli BR-42 (pAP-B03)(b)in the presence of bacteriophage BP-1

(4)初步推断WSH-Z06 对噬菌体的抗性机制可能与麦芽糖转运蛋白LamB 的突变有关，即LamB 的失活阻止了噬菌体对宿主菌的吸附，该机制还有待于进一步的研究。

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