蝇蛆壳聚糖的纯化及结构性质*

宋春丽，任健1，，马翠翠1，

1(齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，哈尔滨 齐齐哈尔，161006)

2(齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，哈尔滨 齐齐哈尔，161006)

甲壳素是一种自然界生物合成量位居第二的天然高分子聚合物，它的基本结构单位是β-1，4-N-乙酰-氨基葡萄糖。甲壳素的脱乙酰化产物称为壳聚糖，该物质具有生物可降解性、生物相容性、镇痛等诸多良好的功能特性，在医药、食品、废水处理等多个行业中广泛应用［1－2］。目前，主要是以虾蟹壳为原料生产壳聚糖，但是由于原料受地域和季节影响［3］，因而人工养殖的蝇蛆壳为壳聚糖的生产原料倍受关注，不仅是因为蝇蛆壳的甲壳素含量高(30% ～54.8%)、品质好(色素及钙盐含量少)，更重要的是可以减少对环境的污染［4］。

壳聚糖氨基含量和分子质量和相对分子质量对功能性质，如抑菌性等影响很大［5］，本文采用凝胶层析(SephacrylTMS-300)对蝇蛆壳聚糖的进行分级纯化，得到不同相对分子质量的组分，并对分离的组分进行红外光谱分析和X-射线衍射分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料与实验仪器

蝇蛆壳，取自齐齐哈尔市建华区齐佳生态养殖专业合作社;蝇蛆壳壳聚糖，实验室自制，制备方法见文献［6］，脱乙酰度为79.45%;SephacrylTMS-300，GE Health 公司;D-氨基葡萄糖，上海伯奥生物科技公司;其余试剂均为分析纯。

电热恒温水浴锅(DK-98-Ⅱ型)，天津市泰斯特仪器有限公司;离心机(TDL-5-A 型)，上海安亭科学仪器厂;高效液相色谱仪(Agilent 1200 型)，美国安捷伦;TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱、TSK-GEL G-3 000PW xL柱(7.8 mm×300 mm)，上海锦华层析设备厂;X-射线衍射仪(D8-FOCUS 型)，德国布鲁克公司;傅里叶变换红外光谱仪(Spectrum One 型)，美国PE 公司。

1.2 壳聚糖的凝胶层析分离纯化

称取一定量的蝇蛆壳壳聚糖，溶于体积分数1%乙酸溶液中，上SephacrylTMS-300 柱(1.6 cm ×100 cm)分离，采用0.05 mol/L 乙酸-乙酸钠缓冲液洗脱，上样量为15 mL(浓度为5 mg/mL)，流速为0.5 mL/min，每管收集5 mL。

1.3 壳聚糖的纯度鉴定

采用高效凝胶渗透色谱法测定。仪器为Agilent 1200，配备示差折光检测器，层析柱为TSK-GEL G-6 000 PWxL 柱(7.8 mm ×300 mm)与TSK-GEL G-3 000 PW xL 柱(7.8 mm×300 mm)串联;流动相为水(pH 6.0)，流速1.0 mL/min;柱温25 ℃;进样量20 μL。

1.4 壳聚糖理论氨基葡萄糖含量及纯度的计算

壳聚糖的实测氨基葡萄糖含量的测定:取浓度为0.125 ～1.0 g/L 的标准氨基葡萄糖溶液0.8 mL，加入1 mL 质量分数1 % 间苯二酚水溶液，7.5 mL H2SO4，混匀，沸水浴加热30 min，冷却至室温，加水至10 mL，混匀。以试剂空白为对照，测定490 nm 处吸光值，得浓度和吸光值的关系曲线。壳聚糖酸水解后测定其氨基葡萄糖含量，测定方法同上。

壳聚糖的纯度可以定义为:壳聚糖实测氨基葡萄糖含量与理论氨基葡萄糖含量的比值。理论氨基葡萄糖含量和壳聚糖的纯度的计算:

1.5 壳聚糖的相对分子质量测定

采用黏度法测定壳聚糖的相对分子质量。精确称取恒重的壳聚糖样品1 g，将其溶于50 mL 乙酸-氯化钠溶剂中(0.1 mol/L 乙酸;0.2 mol/L 氯化钠)。采用乌氏黏度计测定25℃时壳聚糖的黏度，然后利用公式计算壳聚糖的相对分子质量。

其中:η 为比浓黏度;ηsp 为增比黏度;ηs 为溶剂黏度;η0 为样品黏度。

相对分子质量计算公式:

其中:K 和α 是常数，K = 1.424 × 10－3，α =0.96，M为相对分子质量。

1.6 壳聚糖的结构分析

1.6.1 壳聚糖的红外光谱分析

分别称取干燥的壳聚糖样品，KBr 研磨压片后，采用傅里叶变换红外光谱仪扫描分析，扫描范围400～4 000 cm－1。

1.6.2 壳聚糖的X-射线衍射分析

根据参考文献［7］，将样品研磨、烘干、过200 目筛，制片，采用全自动X-射线衍射仪测定。以Cu 靶Kαl(40 kV，20 mA)作为射线源，以4.5°/min 的扫描速率从1°扫描到40°。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖氨基葡萄糖含量及纯度测定

壳聚糖组分1 和组分2 在TSK 上的色谱分布图见图1。

图1 壳聚糖组分1(A)和组分2(B)在TSK 柱上的色谱图Fig.1 Molecular weight distribution of two prepared fractions of chitosan on TSK column

从图1 可以看出，组分1 和组分2 都是单一峰，说明二者相对分子质量分布比较均一，这初步证实了这组分的纯度较高。

通过测定壳聚糖理论氨基葡萄糖含量，进而计算壳聚糖的纯度。标准氨基葡萄糖浓度与490 nm 的吸光值的关系曲线为y= 0.216 4x－ 0.000 1(R2=0.998 5)，测定壳聚糖组分1 和组分2 的氨基葡萄糖含量，计算得出，壳聚糖组分1 和组分2 的纯度分别为98.5%和98.2%。

2.2 壳聚糖相对分子质量的测定

根据壳聚糖黏度与相对分子质量之间的关系计算壳聚糖的相对分子质量，测定组分1 和组分2 的相对分子质量分别为620 和230 kDa。

2.3 壳聚糖组分的红外光谱分析

壳聚糖组分1 和组分2 的红外光谱图见图2。

图2 商品壳聚糖和壳聚糖组分1、组分2 的红外光谱图Fig.2 FTIR spectra of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

从图2 可以看出，组分1 和组分2 在3 600 ～3 200 cm－1为O—H 的伸缩振动;3 200 ～2 800 cm－1为C—H 的伸缩振动;1 400 ～1 200 cm－1之间出现的C—H 的伸缩振动，这些吸收峰都是糖类的特征吸收峰［8］。组分1 的高频区吸收峰偏高(2 922.86 cm－1)，这可能是其结晶度低所造成的，结晶度低的原因是脱乙酰度较低。而组分1 在1 564.37 ～1 590.15 cm－1酰胺II 谱带吸收峰比组分2 弱，说明组分1 的脱乙酰度较低。

与商品壳聚糖的红外光谱图比较，组分1 和组分2 均在1 013 cm－1(C6—OH 特征吸收峰)和1 120 cm－1附近(C3—OH 特征吸收峰)有较强的吸收峰，说明三者都是甲壳素的衍生产物。

2.4 壳聚糖组分的X-射线衍生分析

商品壳聚糖和壳聚糖组分1、组分2 的X-射线衍射图谱见图3。

图3 商品壳聚糖(A)和壳聚糖组分1(B)、组分2(C)的X-射线衍射图谱Fig. 3 X-ray diagram of two prepared fractions of chitosan and commercial chitosan

从图3 可以看出，组分1 和组分2 的衍射峰与商品壳聚糖的衍射峰位置类似，均在2θ = 10.27°、15.73°、19.84°附近出现。但组分1 和组分2 在2θ=10°左右的衍射峰几乎消失，说明分子间的作用力比较弱。此外，组分1 在2θ =15°附近的衍射峰较强，在2θ=20°附近的衍射峰很微弱，说明组分1 的结晶度不高，这与红外分析结果一致;组分2 与商品壳聚糖的曲线类似，在2θ =20°时衍射峰型较尖锐，说明结晶度较高。

3 结论

采用SephacrylTMS-300 分离蝇蛆壳聚糖，得到了相对分子质量分别为230 和620 kDa 的2 个组分。高效液相色谱显示两组分均达到了较高的纯度。纯度分析表明两组分纯度分别为98.5%和98.2%。在红外光谱图中2 组分均出现了壳聚糖官能团的特征吸收峰;组分1 结晶度不高，组分2 结晶度较高。

［1］ Aranaz I，Mengíbar M，Harris R，et al. Functional characterization of chitin and chitosan［J］. Current Chemical Biology，2009，3(2):203 －230.

［2］ 滕丽菊，张子勇，唐书泽，等. 壳聚糖的抗菌活性研究［J］. 中国调味品，2008，33(10):48 －51.

［3］ 蒋挺大. 甲壳素［M］. 北京:化学工业出版社，2003，3:246 ～247.

［4］ 贺继东，夏文水. 工程蝇蛆的开发利用和深度加工［J］． 食品工业科技，2002，23(12):90 －93.

［5］ 王岸娜，王璋，许时婴. 离子交换层析色谱法分离壳聚糖［J］. 无锡轻工大学学报，2003，22(6):75 －80.

［6］ 马翠翠，任健. 蝇蛆壳制备壳聚糖的工艺条件研究［J］． 现代食品科技，2013，29 (2):331 －334.

［7］ Yen M T，Yang J H，Mau J L. Physicochemical characterization of chitin and chitosan from crab shells［J］. Carbohydrate Polymers，2009，75 (1):15 －21.

［8］ 姚惠源，胡敏，袁小平，等. 小麦麸皮阿魏酰低聚糖的分离纯化与结构分析［J］. 2009，30(3):79 －83.