柿叶提取物对CCl4致小鼠急性肝损伤保护作用的研究

张 艳，杨建雄，马 蕊，王 芳

（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安710062）

柿（Diospyros kakiL．f）为双子叶植物柿树科 柿树，柿叶为柿的新鲜或干燥叶片．黄酮类化合物是柿叶的主要有效成分［1］，主要以苷类形式存在［2］．已发现的黄酮类化合物有芦丁、黄芪苷（astraglin）、异槲皮素（isoquereitrin）、山奈酚（Kaempferol）等．目前对柿叶黄酮的研究主要集中在软化血管、降脂降压、抗氧化、止血等药理方面［3］，而对其保肝作用尤其是对CCl4诱导的急性肝损伤保护作用的研究却较少．本研究探讨柿叶醇提物乙酸乙酯萃取制剂（EAF）对四氯化碳（CCl4）急性肝损伤的保护作用，为柿叶在保健食品中的进一步开发和利用提供依据．

1 材料和方法

1．1 试剂

ALT、AST、AKP、SOD、GPx、CAT、MDA试剂盒均由南京建成生物工程有限公司提供．化学试剂均为国产分析纯，EAF（黄酮含量为81．05%）溶液为自制．

1．2 动物

雄性昆明种小鼠，50只，体重（20±2）g，由西安交通大学实验动物研究中心提供．

1．3 方法

1．3．1 动物模型与药物处理 选择50只雄性昆明种小鼠，随机分组，每组10只，分别为正常组、模型组（CCl4）、EAF组（低剂量组50mg／kg、中剂量组100mg／kg、高剂量组200mg／kg）．小鼠适应性喂养7d后，给药组采用灌胃给药，正常组和模型组给予等体积的生理盐水．每隔3d称一次体重，根据体重调整给药体积．连续7d后，除正常对照以外，其余各组于末次给药3h后按20mg／kg剂量腹腔注射2%CCl4花生油［4］，正常组注射等体积的花生油，禁食不禁水．24h后眼眶采血，分离血清待用．取血后每只小鼠立即剖腹，取相同部位的一小块肝组织，用10%的福尔马林溶液固定，同时用生理盐水制备成10%的肝匀浆，离心，上清液4℃下保存备用．

1．3．2 肝功能生化检测 血清ALT、AST和AKP活性按试剂盒说明测定．

1．3．3 肝组织生化测定 肝匀浆SOD、GPx、CAT活性及MDA含量按试剂盒说明测定．

1．3．4 肝脏组织病理学检查 肝组织切片经HE染色，光镜下观察肝细胞损伤程度．

1．3．5 数据处理 用SPSS14．0统计软件进行数据处理，结果以±s表示，组间均数比较采用方差分析．

2 结果与讨论

2．1 对小鼠血清ALT、AST和AKP的影响

如表1所示，模型组血清中ALT、AST、AKP的含量明显高于正常组（P＜0．01），与CCl4模型组比较，EAF不同给药组均能显著降低ALT、AST、AKP活性，其中以中剂量组效果最为显著．CCl4进入体内后，经肝微粒体细胞色素P450酶激活，生成三氯甲基自由基（CCl3·），CCl3·可进一步与氧反应，形成具有更强反应活性的CC13O2·，这些自由基与肝细胞内大分子发生共价结合，也可攻击肝细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，引起膜结构和功能完整性的破坏，导致肝细胞肿胀坏死．肝脏内ALT以及AST外流，EAF不同剂量给药组均能显著降低ALT、AST、AKP活性．表明EAF可能通过清除自由基［5］，稳定肝细胞膜正常结构，加强组织修复，抑制脂质过氧化而减轻肝细胞损害．

表1 EAF对小鼠血清ALT、AST及AKP活力的影响Tab．1 Effects of EAF on serum ALT，AST and AKP in carbon tetrachloride intoxicated mice U／L，±s，n＝10

表1 EAF对小鼠血清ALT、AST及AKP活力的影响Tab．1 Effects of EAF on serum ALT，AST and AKP in carbon tetrachloride intoxicated mice U／L，±s，n＝10

注：与正常组比较＊＊P＜0．01，＊P＜0．05；与模型组比较＃＃P＜0．01，＃P＜0．05．

组别ALT AST AKP模型组144．8±10．1＊＊98．68±3．41＊＊427．1±36．80＊＊正常组4．82±2．27 46．97±1．86 157．8±20．09低剂量（50mg／kg）＋CCl4109．3±18．1＃69．16±1．46＃＃281．9±29．40＃＃中剂量（100mg／kg）＋CCl489．02±21．3＃＃65．81±6．09＃＃250．2±24．66＃＃高剂量（200mg／kg）＋CCl4126．2±5．93＃72．90±4．41＃293．1±30．09＃

2．2 对小鼠肝组织SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影响

如表2所示，与正常组比较，CCl4显著降低了模型组小鼠肝匀浆SOD、CAT（P＜0．01）及GPx活性（P＜0．05），同时MDA含量显著升高（P＜0．05）．与模型组比较，EAF对这些变化都有不同程度的抑制作用．其中低、中剂量与模型组比较差异均有显著性（P＜0．01或P＜0．05），而高剂量组SOD、CAT、GPx活性有所增强，MDA含量有所降低，但没有统计学意义（P＞0．05）．

表2 EAF对小鼠肝匀浆SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影响Tab．2 Effects of EAF on MDA，SOD，GPx，and CAT in liver homogenate of in carbon tetrachloride intoxicated mice ±s，n＝10

表2 EAF对小鼠肝匀浆SOD、GPx、CAT活性及MDA含量的影响Tab．2 Effects of EAF on MDA，SOD，GPx，and CAT in liver homogenate of in carbon tetrachloride intoxicated mice ±s，n＝10

注：与正常组比较＊＊P＜0．01，＊P＜0．05；与模型组比较＃＃P＜0．01，＃P＜0．05．

组别SOD（U／mg protein）GPx（U／mg protein）CAT（U／mg protein）MDA（nmol／mg protein）模型组70．79±12．37＊＊526．9±56．53＊30．80±9．93＊＊2．72±0．95＊正常组216．9±40．84 712．6±141．9 73．62±1．78 1．19±0．07低剂量（50mg／kg）＋CCl4105．6±19．34＃567．3±38．42 56．70±13．6＃1．53±0．58＃中剂量（100mg／kg）＋CCl4120．4±23．26＃640．3±43．04＃60．06±10．1＃＃1．47±0．38＃＃高剂量（200mg／kg）＋CCl498．04±19．22 562．0±86．52 42．70±9．92 2．13±0．45

SOD是细胞内主要的防御性抗氧化酶，减少自由基的产生，减轻肝细胞的损伤．MDA能进入膜脂的水相，和膜蛋白、膜磷脂上的—NH2交联形成schiff碱，使细胞膜流动性降低，通透性增加，从而导致膜的功能损伤或丧失［6］．GPx可以催化GSH与各种内源性和外源性亲电子化合物反应，生成无毒性或毒性小的GSH硫结合物．CAT既能有效及时地消除体内细胞代谢产生的毒性物质过氧化氢，又可充当血红蛋白和其他含巯基蛋白的保护剂．这一系列抗氧化酶及脂质过氧化产物的相应变化反映了EAF具有强的清除自由基的能力，其主要成分黄酮类化合物含有的羟基具有很强的供氢能力，可以通过释放羟基上活泼H原子，使其与R·或ROO·结合，向活泼自由基提供H后，可与其他自由基结合成稳定的二聚体，而切断自由基的链式反应，发挥抗氧化作用［7］．

2．3 EAF对小鼠肝组织病理学的影响

病理切片结果见图1．光镜所见正常组小鼠肝小叶结构正常、清晰，细胞排列整齐，大小均匀，细胞核位于细胞中央，圆而边界清．模型组小鼠肝细胞明显水肿、气球样变，肝索排列紊乱，肝细胞解离，肝小叶内点状坏死，中央静脉和汇管区出现弥漫性的炎

图1 EAF对急性肝损伤小鼠肝组织病理改变的影响（HE×400）Fig．1 The histopathological analysis for effect of EAF on acute liver injure in mice（HE，×400）

细胞浸润．低、高剂量组肝细胞仍出现部分空 泡、变性，较模型组有所改善，但效果不明显．中剂量组细胞核结构清晰，体积正常，水肿、坏死、气球样变、炎细胞浸润程度明显减轻，较模型组有显著改善．

结果表明，中剂量（100mg／kg）的柿叶黄酮有较好的保肝效果，而200mg／kg的剂量对肝细胞氧化损伤的保护作用减弱，这一结果与生化测定所得结果一致，也与文献［8－9］报道的较高剂量的酚酸类物质对肝细胞有损害作用的结论一致．

3 结论

EAF对CCl4致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用，100mg／kg的EAF效果较好．其机理可能与降低脂质过氧化反应，清除自由基，保护肝细胞膜，维持膜的正常通透性等有关．这一结果表明，废弃的柿叶可以用来制备对肝脏有一定保护作用的EAF．

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