结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

郝春秋，彭梅娟，谢玉梅，周云，魏欣，马力，王素娜，李瑞娟，张岩，白雪帆，贾战生

第四军医大学 唐都医院感染病诊疗中心，陕西 西安 710038

腺病毒具有宿主范围广、感染率高、包装容量大、繁殖滴度高、安全性好、性质稳定、载体制备较容易等特点[1]，已成为应用最广泛的载体系统之一。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是重要的促组织纤维化蛋白，与肝、肺、肾等许多器官的纤维化密切相关[2]，是促进胶原沉积致肝纤维化的主要细胞因子。RNA干扰（RNA interfer⁃ence，RNAi）可以在转录后水平阻断基因表达，使靶基因沉默，是研究特定基因功能的可靠技术[3]。我们试图利用RNAi原理，构建能介导CTGF基因沉默的复制缺陷型腺病毒载体，为肝纤维化的防治提供一个有用的工具。

1 材料和方法

1.1 材料

腺病毒载体系统（穿梭质粒pShuttle-H1、骨架质粒pAdEasy-1及包装细胞AD-293）由德国学者Reske教授惠赠；大鼠肝星状细胞系HSC-T6购自ATCC；大肠杆菌BJ-5183和DH5α由本实验室保存。

限制性内切酶、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR产物回收试剂盒及Plasmid Purifica⁃tion Kit均为Promega公司产品；脂质体Lipo⁃fectAMINE2000、DMEM、RPMI1640及胎牛血清均为Gibco公司产品；抗CTGF单克隆抗体、抗β-actin抗体购自Abcam公司；山羊抗鼠IgG-HRP抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 靶向CTGF短发夹RNA的设计

根据小干扰 RNA（siRNA）设计原则[4-5]，参考GenBank公布的大鼠 CTGF（NM-022266）核苷酸序列，利用Ambion公司在线（http://www.ambion.com）设计工具，设计4对针对CTGF基因的siRNA序列（TS1～TS4）和1对无关阴性对照序列（TS5），并进行BLAST同源性分析，保证序列的惟一性。为方便克隆与鉴定，在其5'和3'端分别引入BglⅡ和HindⅢ酶切位点，反义片段以后接终止信号TTTTTT以终止转录，形成BglⅡ酶切位点+19nt正义靶序列+9nt loop接头序列+19nt反义靶序列+终止信号+HindⅢ酶切位点的结构（寡核苷酸由上海吉凯基因技术有限公司合成）。见表1。

1.3 腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的构建及鉴定

将合成的单链寡核苷酸退火形成双链DNA并检测无误。用HindⅢ、BglⅡ双酶切穿梭质粒pShut⁃tle-H1（图1），酶切产物纯化后，用T4噬菌体DNA连接酶于16℃连接线性化的pShuttle-H1及退火后的双链DNA 12 h，转化DH5α感受态细菌，在卡那霉素抗性LB平板上于37℃培养过夜，筛选扩增转化的阳性菌落，提取质粒并纯化后获得腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF，用EcoRⅠ酶切鉴定，并将酶切后获得的小片段回收进行测序分析。

1.4 复制缺陷型腺病毒载体Ad.H1-CTGF的包装和滴定

培养腺病毒包装细胞AD-293，达80%～90%汇合时加入1 μg鉴定无误的腺病毒穿梭质粒p-shut⁃tle-CTGF 与 4 μg 骨 架 质 粒 pAdEasy-1，用 Lipo⁃fectAMINE2000脂质体转染，使之进行同源重组，第2 d传代；转染7～10 d后，75%～80%的细胞出现CPE时收集细胞，-80℃和37℃反复冻融3次释毒，离心冻融液收集上清，即为第一代腺病毒载体Ad.H1-CTGF毒种，作为随后大量病毒扩增的原液，3次扩增后获得病毒保存液。同法获得无关阴性对照病毒Ad.H1-Con原液及保存液，均于-80℃保存。病毒滴定采用TCID50法，即将病毒原液梯度稀释至1/10-6～1/10-12，分别接种生长于96孔培养皿中的AD-293细胞，37℃培养72 h，用X-gal染色，计算病毒滴度。

1.5 空斑实验检测腺病毒载体的感染性

将肝星状细胞系HSC-T6细胞低密度铺于6孔板中，培养1 d后达60%～70%融合，用感染复数（MOI）为100的腺病毒载体Ad.H1-CTGF和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染细胞，未感染病毒的细胞为对照，加甲基纤维素覆盖液后37℃培养7 d，吸除覆盖液加结晶紫染色，清洗后观察空斑形成情况。

1.6 Western印迹检测病毒载体对CTGF基因的沉默效果

图1 腺病毒穿梭质粒pShuttle-H1图谱及构建示意图

表1 编码siRNA的DNA双链

HSC-T6细胞于6孔板中培养1 d达60%～70%融合后，用MOI为100的腺病毒载体Ad.H1-CTGF和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染细胞，37℃培养48 h后裂解细胞、提取蛋白，进行SDS-PAGE，然后将蛋白条带电转移到硝酸纤维素膜上，以抗CTGF单克隆抗体为一抗（1∶10）、山羊抗鼠IgG-HRP抗体为二抗（1∶100）进行 Western印迹，检测腺病毒载体对CTGF基因的沉默效果。

2 结果

2.1 含靶序列的单链寡核苷酸退火产物检测

将合成的4对含靶序列、1对阴性对照序列的单链寡核苷酸于90℃温育4 min、70℃温育10 min，缓慢冷却至室温进行退火，用12%非变性PAGE检测退火形成双链DNA的效率，均达90%以上（图2），提示退火产物合格，可用来构建腺病毒穿梭质粒。

2.2 腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的鉴定

由腺病毒穿梭质粒pShuttle-H1图谱（图1）可看出，MCS中含有2个EcoRⅠ酶切位点，EcoRⅠ酶切后形成2个片段，大片段6600 bp，小片段为300 bp的H1启动子序列。在BglⅡ和HindⅢ位点间插入合成的寡核苷酸靶序列后，小片段长度则变为360 bp。电泳结果（图3）显示，阴性对照质粒p-shut⁃tle-H1酶切小片段为300 bp，阳性克隆质粒p-shut⁃tle-CTGF酶切小片段为360 bp，大片段均为6600 bp，初步证明重组腺病毒穿梭质粒构建正确。回收360 bp小片段进行测序，证实序列完全正确（基因序列略）。

图2 退火产物电泳图谱

图3 重组腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF的酶切鉴定

2.3 腺病毒载体的滴定和感染性鉴定

采用TCID50法对病毒进行滴定，测出病毒保存液滴度为4×1010PFU/mL。用MOI为100的目标病毒Ad.H1-CTGF和阴性对照病毒Ad.H1-Con感染HSC-T6细胞，7 d后目标病毒Ad.H1-CTGF组和阴性对照病毒组Ad.H1-Con均有大量空斑形成，未感染病毒的HSC-T6细胞未见空斑形成，说明构建的目标病毒和阴性无关对照病毒均具有较好的感染性（图4）。

2.4 腺病毒载体对CTGF基因沉默效果的Western印迹鉴定

Western印迹检测发现，内参照蛋白β-actin的表达水平在6组之间无明显差异；而CTGF蛋白表达在包装的4组目标病毒感染HSC-T6细胞后均有不同程度降低，其中含靶序列TS3的病毒感染组降低最显著；无关序列阴性对照病毒感染组CTGF蛋白表达与未感染细胞组一样，未见降低（图5）。提示构建的含TS3靶序列的腺病毒载体具有较好的沉默CTGF基因的效果，将其命名为Ad.H1-CTGF，可作为以后抗纤维化研究的工具。

3 讨论

我国是肝病大国，随着慢性肝病病程的延续，其纤维化的进程也一直持续，由于目前缺乏行之有效的根治办法，这些人都面临着肝硬化的潜在威胁，这已成了严峻的社会问题。因此，寻找有效的抗纤维化方法，阻止慢性肝病患者的肝硬化趋势，已成为我国乃至全球亟待解决的问题。

图4 包装的腺病毒感染滴定

图5 各组病毒对CTGF表达的影响

肝纤维化的成因，普遍认为与肝星状细胞（HSC）的活化有关[6]，转化生长因子β（TGF-β）是目前公认的致纤维化最强的细胞因子之一，其促纤维化作用主要是通过诱导其下游因子CTGF的表达，活化HSC来完成。业已证明，CTGF与肝、肺、肾等器官的纤维化、皮肤瘢痕形成、创伤修复及动脉粥样硬化密切相关[7]。由于CTGF的生物学效应相对单一，主要介导TGF-β的促细胞增殖和细胞外基质（ECM）合成等作用，因此，阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种更特异、更有效的防止肝纤维化的手段。

RNAi技术具有高效性和高特异性，作为关闭基因的新技术，已被广泛应用[8]。RNAi的产生需要向细胞内导入siRNA或在细胞内表达siRNA，前者是将体外合成的siRNA直接导入细胞，虽简单，但导入的siRNA易降解，且以瞬时表达为主，目前已较少使用；后者通过表达siRNA的质粒或病毒载体在靶细胞内转录siRNA，发挥RNAi作用，因方便、稳定和高效而成为主流方法。腺病毒载体可以直接、高效、稳定地感染细胞，避免了质粒转染效率低而带来的不便，逐渐成为该领域的研究热点[9-13]。

我们根据siRNA设计原则[4-5]，设计了4对针对CTGF基因的siRNA序列和1对无关阴性对照序列，退火形成双链DNA后定向克隆至pShuttle-H1的H1启动子下游，获得腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF1-5，经酶切、测序鉴定无误后与骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞，同源重组后获得4株腺病毒载体和1株阴性对照病毒，空斑实验证实它们均具有较好的感染性，Western印迹检测发现4组目标病毒对HSC-T6细胞CTGF的表达均有不同程度的抑制，其中Ad.H1-CTGF3的抑制效果最好，抑制率达85%，达到了设计要求。该腺病毒载体的构建成功，将为抗纤维化的研究提供可行的工具，为肝纤维化和肝硬化的防治奠定基础。

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