A→O血型转变制备通用型红细胞过程中残留α-N-乙酰半乳糖胺酶检测方法的建立

高红伟 ，李素波 ，鲍国强 ，张雪 ，徐丽娟 ，檀英霞 ，王颖丽 ，季守平 ，宫锋

军事医学科学院 a.野战输血研究所，北京 100850；b.附属医院输血科，北京 100071

红细胞血型转变技术是解决血型错配和血液浪费的重要技术之一。本研究室于1999年开始血型转变工作，已成功地将B型红细胞转变为O型，并获得国家食品药品监督管理局的临床研究批文[1-2]。由于A型红细胞的抗原结构比较复杂，A型红细胞血型改造工作在国内外都进展不大，直到2007年，ZymeQuest公司的Liu等从原核生物中克隆并表达了新型的α-N-乙酰半乳糖胺酶（α-N-acetylgalactos⁃aminidase，NAGA），开始了A型红细胞血型转变的新纪元[3]。本研究室也同期开展了A→O血型转变的研究工作，并从国内临床的脑膜脓毒性金黄杆菌（Elizabethkingia meningosepticum）标本中克隆出新型NAGA基因，用于A→O血型转变研究。重组表达的NAGA底物专一性强、比活力高，在接近红细胞的生理条件下，能成功地将A型红细胞转变为O型红细胞[4]。

酶解转变的O型红细胞用于临床的关键问题之一就是不能携带任何外源蛋白进入人体，因此检测酶解改造O型红细胞中是否残留NAGA及确定其残留量是必须解决的问题。酶联免疫吸附测定技术（ELISA）是检测微量蛋白的常规方法之一，可以检测到纳克（ng）级的微量蛋白。由于市场上没有针对脑膜脓毒性金黄杆菌NAGA的商品化抗体出售，因此我们自制了NAGA的兔多抗，并进行了特异性验证[5]。另外，本研究室克隆的NAGA的C端带有6×His标签，因此我们拟利用NAGA的兔多抗和抗His的单抗，采用间接ELISA法检测A→O血型转变终产品中及洗涤过程中NAGA的残留量，为酶解法制备的通用型红细胞的安全性评价提供简单实用的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

健康人A型血由军事医学科学院附属医院输血科提供；重组NAGA（纯度＞95%）为本研究室制备[4]；NAGA的兔多抗（rProtein A纯化，纯度＞95%，效价1∶1×105）为本研究室制备[5]；鼠抗 His单抗、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG为中杉公司产品；TMB为Sigma公司产品；红细胞裂解液购自碧云天生物技术研究所；其他试剂为国产分析纯产品。红细胞专用水平离心机为KUBOTA 2100；红细胞酶解反应箱由本研究室和军事医学科学院仪器中心联合研制。

1.2 微量NAGA检测方法的建立

采用间接ELISA方法进行检测。以10 μg/mL NAGA兔多抗包被酶联板（100 μL/孔），4℃湿盒中孵育过夜，次日洗板封闭后加入不同浓度的NAGA（从微克级依次梯度稀释至皮克级），37℃孵育1 h，洗板后加入100 μL抗His单抗（1∶3000稀释），37℃孵育0.5 h，洗板后加入100 μL HRP标记的羊抗鼠IgG（1∶10 000稀释），37℃孵育0.5 h，洗板，TMB显色，检测D450nm值，并制作标准曲线。

1.3 红细胞的酶解

将健康人A型血于2000 r/min离心5 min，去上清，取1 mL压积红细胞（packed red blood cells，pRBC），用酶解缓冲液（250 mmol/L甘氨酸，3 mmol/L NaCl，pH6.8）按1∶4的体积比洗2次，按0.015 mg/mL pRBC加入NAGA，放入红细胞酶解反应箱中于26℃缓慢上下振荡孵育1 h，待血型转变为O型后停止孵育，用PBS按1∶4的体积比洗涤红细胞4次，2000 r/min离心5 min后弃上清，保留每次洗涤上清和每次洗涤后的红细胞以备检测。

1.4 残留酶的检测

对4次洗涤上清用上述建立的间接ELISA方法直接进行检测，每次洗涤后获得的红细胞用红细胞裂解液按1∶9的体积比裂解后检测。

2 结果

2.1 微量NAGA检测方法的建立

采用间接ELISA法，经过3次独立重复，绘制的标准曲线基本一致，在1～15 ng/mL区间的标准曲线如图1所示。本法的检测下限为1 ng/mL。

2.2 残留酶的检测结果

将4次洗涤上清和每次洗涤后的红细胞裂解液用上述建立的间接ELISA方法直接进行检测，检测结果见表1。通过对洗涤后的红细胞和洗涤液中残留酶量的检测，确定经过4次洗涤后，残留酶量达到检测水平以下。

图1 微量NAGA检测的标准曲线

表1 通用型红细胞制备过程中残留NAGA的检测

3 讨论

在A→O血型转变过程中，NAGA是惟一引入的外源蛋白，因此在A→O酶解转变反应完成后，将NAGA清洗到安全微量，是通用型红细胞临床前研究中必须解决的问题。在B→O血型转变的研究中，美国纽约血液研究中心在洛克菲勒医院临床研究中心进行的临床试验结果证明，当一个单位（200 mL）的通用型红细胞（由B型红细胞酶解制备的O型红细胞）中残留的α-半乳糖苷酶总量为2.6±1.9 μg（相当于22.5 ng/mL）时，受试的4名健康成年人均未产生抗α-半乳糖苷酶抗体[6]。参考美国FDA的标准，我们在B→O研究中最后确定制备的酶解转变的人O型红细胞（ECHORBC）中残留α-半乳糖苷酶的安全剂量为10 ng/mL[7]。关于A→O血型转变中通用型红细胞中残留NAGA的安全剂量，至少也应达到纳克级，因此，我们需要建立能够检测纳克级NAGA的方法。

我们曾报道用SDS-PAGE银染法结合酶活性测定来检测由B型血制备的通用型血中α-半乳糖苷酶的残留量[7]，但这种方法的最低检测限为10 ng/孔，因此检测下限只能到1 μg/mL，为了检测洗涤上清中的残留酶量，必须将洗涤上清超滤浓缩后再检测，步骤较繁琐且不能准确定量。ELISA是检测微量蛋白的常规方法之一，可检测到纳克级的微量蛋白。因此我们自制了NAGA的特异性兔多抗，利用此兔多抗和抗His的单抗，建立了间接ELISA法检测A→O血型转变终产品中及洗涤过程中NAGA残留量的方法，结果显示该方法的检测下限为1 ng/mL，在我们需要的检测范围（1～15 ng/mL）具有良好的线性关系（R2=0.997）。该方法不仅比SDS-PAGE银染法、酶活性测定法灵敏，还具备操作简单、重复性好等优点，为酶解法制备的通用型红细胞的安全性评价提供了简单实用的检测方法。

[1]Zhang Yang-pei,Gong Feng,Bao Guo-qiang,et al.B to O erythrocyte conversion by the recombinant α-galactosidase[J].Chinese Med J,2007,120(13):1145-1150.

[2]鲍国强,章扬培.ABO血型改造制备通用型红细胞[J].中国输血杂志,2008,21(12):909-911.

[3]Liu Q Y,Sulzenbacher G,Yuan H,et al.Bacterial glycosidas⁃es for the production of universal red blood cells[J].Nat Bio⁃technol,2007,25(4):454-464.

[4]郁成雨,徐华,王立生,等.新型高比活力α-N-乙酰半乳糖胺酶应用于人红细胞A→O血型改造[J].科学通报,2008,53(11):1288-1295.

[5]李素波,张雪,鲍国强,等.α-N-乙酰半乳糖胺酶多克隆抗体的制备及特异性鉴定[J].中国输血杂志,2012,25(7):652-654.

[6]Lenny L L, Hurst R, Goldstein J,et al. Transfusions to group O subjects of 2 units of red cells enzymatically convert⁃ed from group B to group O[J].Transfusion,1994,34(3):209-214.

[7]王颖丽,由英,高红伟,等.B→O血型改造制备通用型血过程中残留工具酶的检测[J].军事医学科学院院刊,2004,28(6):546-548.