齐口裂腹鱼PGC-1α基因编码区的克隆及其在肌肉组织中的表达

李瑞文 ，林亚秋 ，郑玉才 ，张润锋 ，宫佳琦 ，晁珊珊

1.西南民族大学 生命科学与技术学院，四川 成都 610041；2.成都市第九人民医院·成都市妇产科医院 生殖与不孕研究所，四川 成都 610091；3.湖北师范学院 生命科学学院，湖北 黄石 435002

过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ co⁃activator-1α，PGC-1α）属于与能量代谢关系最密切的PGC-1转录辅助活化因子家族，最早在酵母双杂交体系中作为调控脂肪细胞分化的核受体PPARγ的辅激活因子被发现[1]。PGC-1α主要在能量代谢旺盛或富含线粒体的组织如心脏、肝脏、肌肉、脑、肾和棕色脂肪中表达，具有明显的组织特异性[2-3]。同时，寒冷、禁食、锻炼和激素等因素刺激可诱导PGC-1α表达，然后与不同的转录因子结合，在不同组织和生物反应过程中发挥其多种功能。因PGC-1α在机体诸多代谢过程，如肌纤维类型转化、线粒体生成、氧化代谢、适应性产热、葡萄糖代谢和肥胖及相关疾病治疗[4-7]等中发挥重要作用，所以成为近年来备受关注的核受体转录辅助激活因子。关于PGC-1α的研究多集中于陆生动物，在水生动物中的研究报道较少[8-9]。有报道显示，PGC-1α在鱼类和陆生动物某些方面的调控作用存在差异，如线粒体生成和对温度的敏感性方面[8-10]。因此，为了解析PGC-1α在鱼类和陆上动物中存在的差异，需要首先阐明该基因在鱼类中的序列特征。

齐口裂腹鱼是我国青藏高原特有的冷水性鱼类，属鲤形目-鲤科-裂腹鱼亚科-裂腹鱼属。其肉质细嫩、味道鲜美，赖氨酸含量极为丰富，可作为赖氨酸的天然强化食品，在我国西部及东北地区的冷水养殖中具有很大的发展潜力和广阔的市场养殖前景。我们以齐口裂腹鱼肌肉组织为研究对象，通过克隆得到PGC-1α基因编码区序列，检测了其在基础状态和禁食状态下在白肌和红肌中的表达情况，为研究PGC-1α在齐口裂腹鱼肌肉中的调控作用提供了基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

齐口裂腹鱼（500±12 g）购自四川省雅安市芦山养殖场，运回实验室后，在养殖单位为300 L的水族箱内用海大牌鲤鱼饲料饲养1周后开始正式实验。实验用水为曝气后自来水（pH6.5），实验期间控制水温为20±1℃，水体溶氧保持在5.0 mg/L以上。实验分2组，对照组饲喂商业饲料，实验组2周未饲喂任何饲料，2周后取对照组和实验组齐口裂腹鱼的红肌和白肌组织，置液氮内备用。

大肠杆菌DH5α感受态细胞、pMD-18T载体、反转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq（2×）染料、Taq DNA聚合酶购自大连TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自博大泰克公司。

1.2 齐口裂腹鱼PGC-1α基因的克隆与序列分析

严格按照Invitrogen公司TRIzol试剂说明书提取齐口裂腹鱼红肌组织的总RNA，用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。用1 μg总RNA进行反转录，按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0的方法，以 Oligo（dT）为引物合成cDNA第一链。根据GenBank中斑马鱼（Danio re⁃rio）PGC-1α 基 因 序 列（M_002667531，AY998087，FJ710604，DQ017637），用Primer Premier 5.0软件设计2对PCR引物（包括完整的开放读框）F1（5'-GGATGGCGTGGGACAGGTGTAATC-3'）、R1（5'-GC TGGGGTGGTGCTGTCTCGTT-3）和 F2（5'-CTGAG CAAGGCGTCCTCCACTATG-3'）、R2（5'-TTACCTTC TCAGGCTGTACTGGG-3'），产物长度分别为 1343、1425 bp，克隆策略见图1。25 μL PCR反应体系包括超纯水 16.375 μL、2.5 mmol/L dNTP 混合液 2 μL、PCR 缓冲液 2.5 μL、25 mmol/L MgCl21.5 μL、cDNA 1.5 μL、25 mol/L 引 物 各 0.5 μL、0.5 U/L Taq DNA聚合酶0.125 μL。PCR条件：94℃预变性5 min；95℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 1.5 min，38个循环；72℃延伸10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA回收试剂盒回收目的条带，回收产物连接pMD-18T载体，转化后筛选阳性克隆，提取质粒并由上海英骏公司完成DNA测序。测序后采用NCBI的BLAST进行序列同源性比对，用在线软件（http://www.marksgeneticsoftware.net/）确定转录因子结合位点，用MEGA软件制作物种进化树。

1.3 半定量RT-PCR检测禁食状态下的基因表达

图1 齐口裂腹鱼PGC-1α基因cDNA的克隆策略

参照1.2的方法提取对照组和禁食组齐口裂腹鱼红肌和白肌组织的总RNA并进行反转录。用Primer Premier 5.0软件根据齐口裂腹鱼β-actin基因 序 列（JQ013000）和 所 获 得 的 PGC-1α 序 列（JN195738）设计特异引物βF（GATTCGCTGGAGAT GATGCT）、βR（CGTTGTAGAAGGTGTGATGCC）（长度为219 bp）和 PF（GCTGCCTTGGTTGGTGAA）、PR（CCTTGCCACCTGGGTATTG）（长度为 439 bp），利用半定量RT-PCR检测PGC-1α基因在红肌和白肌中的表达情况。PGC-1α基因和β-actin基因PCR反应体系同PGC-1α基因的克隆测序。PCR条件：94℃ 2 min；94℃ 30 s，56.8℃ 60 s/54.5℃ 60 s，72℃ 60 s，33个循环；72℃延伸10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用Bio-Rad凝胶成像系统拍照，用Quantity one软件分析。数据用PGC-1α与β-actin条带的光密度比值表示。

1.4 数据分析

采用SPSS 13.0软件分析所得数据，用x±s表示；采用t检验进行显著性分析，当P＜0.05时为差异显著，P＜0.01时差异极显著。

2 结果

2.1 齐口裂腹鱼PGC-1α基因cDNA的克隆及序列分析

按照图1的克隆策略，采用RT-PCR方法对齐口裂腹鱼红肌中的PGC-1α基因进行扩增，均获得2条特异区带，与预期片段大小一致（图2）。获得的特异扩增序列经胶回收和双向测定后，拼接得到其cDNA序列2633 bp（GenBank登录号为JN195738），其中开放读框（ORF）为2631 bp，编码876个氨基酸残基。转录因子结合位点分析表明，该序列包括MyOD、CREB和C/EBP等结合位点。氨基酸序列分析发现N端含有LXXLL（142～146残基）转录激活区，C端含有一个RNA结合区域（755～822残基）和富含丝氨酸/精氨酸的结构域（SR结构域）（646～677残基）（图3）。BLAST比对结果显示齐口裂腹鱼的PGC-1α氨基酸序列同GenBank登录的人、小鼠、大鼠、牛、猪、鸡、斑马鱼、草鱼、虹鳟、金体美鳊、弓鳍鱼、金鱼和线翎电鳗的PGC-1α氨基酸序列的同源性为49%～93%，绘制的进化树见图4。

图2 齐口裂腹鱼肌肉组织组织PGC-1α基因的RT-PCR结果

2.2 基础状态和禁食状态下PGC-1α mRNA表达水平的变化

取对照组和禁食处理2周的实验组齐口裂腹鱼的红肌和白肌，用半定量RT-PCR检测PGC-1α mRNA表达水平的变化。结果表明，在基础状态下，PGC-1α在红肌中的表达显著高于白肌中（P＜0.05），与对照组相比，在禁食诱导2周的情况下，PGC-1α mRNA在红肌和白肌中的表达水平显著升高（P＜0.05）（图5）。这一结果证明通过禁食诱导可以显著提高PGC-1α在肌肉中的表达水平。

3 讨论

PGC-1家族包括PGC-1α、PGC-1β和PGC-1相关辅激活因子（PGC-1-related coactivator，PRC）等3个成员，是迄今与能量代谢关系最为密切的转录因子家族[2]，在许多脊椎动物如灵长类、啮齿动物、反刍动物、鸟类、两栖类和鱼类中都存在[11]。但关于PGC-1α在鱼类中的序列特征分析尚缺乏。本研究获得了齐口裂腹鱼PGC-1α基因的cDNA序列，转录因子结合位点分析发现齐口裂腹鱼具有其他哺乳动物所有的MyOD、CREB、C/EBP等结合位点，但不存在MEF-2和胰岛素应答序列（IRS）结合位点。PGC-1α蛋白质序列与其他脊椎动物具有相似的典型结构域，即N端含有LXXLL转录激活区，C端含有RNA结合区和SR结构域。蛋白质同源性分析发现，齐口裂腹鱼的PGC-1α与同鲤科的草鱼、金鱼和斑马鱼的同源性较高，分别为93%、91%和88%，但与陆生动物的同源性较低。以上数据提示PGC-1α可能在鱼类和陆生动物中存在相同和不同的作用。

为了研究PGC-1α在齐口裂腹鱼肌肉中的调控作用，我们用半定量RT-PCR方法检测了其在齐口裂腹鱼白肌和红肌中的表达水平，发现在基础状态下，PGC-1α在红肌中的表达显著高于白肌中。这与PGC-1α的组织表达特异性相符，因为与白肌相比，红肌富含线粒体。Tiraby等也指出，PGC-1α在新生儿及哺乳动物的棕色脂肪细胞中的表达量显著高于白色脂肪细胞[12]，与本实验结果相一致。对陆上动物，多采用体外诱导PGC-1α表达来研究该基因在肌肉中的功能，如通过运动、温度等探讨其对肌肉线粒体和肌纤维类型转换的影响，但这2种手段在鱼类中难以施展[8-9,13]。我们还检测了禁食状态下PGC-1α在红肌和白肌中的表达情况，发现禁食可以显著诱导该基因在齐口裂腹鱼肌肉中的表达水平，提示可以通过禁食诱导PGC-1α表达，进而检测与肌肉能量代谢相关基因的变化，最终阐明PGC-1α在肌肉中的调控作用。

图3 齐口裂腹鱼PGC-1α核苷酸序列和推测的氨基酸序列

图4 齐口裂腹鱼PGC-1α氨基酸序列进化树

图5 PGC-1α在齐口裂腹鱼红肌和白肌中的表达

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