重组SCIRR39多克隆抗体的制备及检测

倪艳丽，李欣，刘少君

军事医学科学院 基础医学研究所，蛋白质组学国家重点实验室，北京 100850

脊髓损伤与修复反应受多种因素影响，是有多种分子参与的复杂的病理过程，目前其分子机理仍不明确，因而无法找到有效干预措施。脊髓损伤与修复蛋白39（spinal cord injury and regeneration re⁃lated protein 39，SCIRR39）基因是我们克隆到的在大鼠脊髓损伤及修复过程中上调表达的基因[1]，是大鼠核糖核酸酶抑制因子基因的突变体[2-4]，其编码的蛋白以前只发现存在于胞浆内，而近年有报道显示该蛋白还存在于细胞核及线粒体中[5]，但功能不详。为进一步研究该蛋白在中枢神经系统和其他组织中的分布，及其在脊髓损伤修复过程中可能的作用，我们制备了针对该蛋白的特异性抗体，为中枢神经系统损伤与修复机理研究提供有效的临床干预线索。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性成年日本大耳白兔（体质量2.5 kg）购自军事医学科学院动物中心；大肠杆菌BL21（DE3）由本室保存；克隆载体pGEM-T/T easy、琼脂糖、质粒提取试剂盒购自Promega公司；EcoRⅠ、BamHⅠ等常用限制性内切酶，DL2000 DNA marker，T4DNA连接酶，LA Taq、Pyrobest DNA 聚合酶，IPTG，X-gal，dNTP均购自TaKaRa公司；Super ScriptⅡ反转录酶、TRIzol试剂购自Invitrogen公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Qiagen公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 PCR扩增Scirr39基因

从大鼠全横断损伤脊髓提取RNA，反转录成cDNA，以此为模板扩增Scirr39基因片段。两端引物分 别 为 39-ORF-5'（ATGTCTCTGGACATCCAGTC）和 39-ORF-3'（TCAGGAGATGACCCTCAGGGATG GC）。PCR 条件：94℃ 2 min，然后以 94℃ 20 s、60℃ 30 s、72℃ 2 min 进 行 30 个 循 环 ，72℃ 7 min。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收后，T-A克隆入pGEM-T easy载体中，将重组载体转化感受态大肠杆菌DH5α，以EcoRⅠ酶切鉴定重组克隆后进一步测序鉴定，保存含有正确重组载体的菌种。

1.3 pGEX-GST-SCIRR39-C融合表达载体的构建

以构建的Scirr39 ORF载体为模板PCR扩增SCIRR39-C端抗原表位编码DNA序列，引物分别为E39-N（CGTGGATCCGGCGGCGGCGGCAGCGGCG GCGGCGGCAGCGCGGAACTGTGCCAGGGCCCG）和E39-C（CGGGAATTCTCAGCTAATCACGCGCAGGC TCGGTTTATCT），两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点（下划线序列）及保护碱基，并在上游引物的5'端引入10个甘氨酸接头。PCR条件：94℃ 5 min，然后以 94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min 进行25个循环，72℃ 7 min。PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收后，BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切回收目的片段，与经相同酶消化的表达载体pGEX-4T-2连接，转化大肠杆菌DH5α，获得表达载体 pGEX-GST-SCIRR39-C，经 BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切和测序验证，表明目的基因已插入pGEX-4T-2。

1.4 GST-SCIRR39-C融合蛋白的原核表达和纯化

把pGEX-GST-SCIRR39-C转化表达菌株BL21（DE3），阳性克隆用LB培养基于37℃振摇过夜，取100 μL菌液加入10 mL氨苄西林抗性的LB培养基中，继续培养，D600nm达0.6～0.8时加入0.2 mmol/L IPTG诱导12～16 h，收集菌体，PBS洗3次，超声波破碎，收集上清，用预装谷胱甘肽琼脂糖凝胶的GST rap FF柱亲和纯化，再用还原性谷胱甘肽洗脱GST-SCIRR39-C融合蛋白，所有纯化操作均在GE Health公司ÄKTA Prime蛋白纯化系统上进行，最后用SDS-PAGE鉴定融合蛋白的纯化结果。

1.5 SCIRR39-C抗原表位蛋白的分离

用1 mL注射器，将80 μL凝血酶与920 μL 1×PBS的混合液注入GST rap柱，封闭柱两端，23～24℃放置16 h；采用1 mL注射器，用3 mL 1×PBS以1 mL/min的流速洗下柱中解离下来的SCIRR39-C蛋白（悬于冰上操作），随后用10 mL洗脱缓冲液以1 mL/min的流速洗脱柱中的GST蛋白（悬于冰上操作），以评价凝血酶酶切效率。纯化后的SCIRR39-C蛋白经冷冻干燥浓缩，以备检测抗体效价时使用。

1.6 抗体制备

取饲养1周、体质量为2.5 kg的纯种日本大耳白兔，免疫前从耳缘静脉取正常血清作为对照。将1 mg抗原与等体积弗氏完全佐剂混合直到形成乳浊液，采用背部多点皮下注射；2周后，取1 mg抗原与等体积弗氏不完全佐剂充分混匀，背部多点注射进行二次加强免疫；免疫后7～10 d从耳缘静脉取血，ELISA测定抗体效价，若滴度小于1∶1000，进一步加强免疫，要求每2周免疫一次，直到抗体效价达到所需滴度；到所需滴度后的第10 d从颈动脉采血，采集的血液室温斜置30 min，移到4℃冰箱待血清析出，收集血清后1000 r/min离心10 min，0.5 mL/支分装，-70℃保存备用。

1.7 ELISA测定抗体滴度

用pH9.6的包被缓冲液将免疫所用蛋白稀释至所需浓度（100 ng/100 μL），在酶标板每孔中加入100 μL，并将板置于湿盒中，4℃过夜或37℃保温4 h；用PBS-T洗板3次后每孔加入200 μL封闭液，于37℃保温1 h，随后用PBS-T洗板3次；一抗用生理盐水进行 1/10 梯度稀释，100 μL/孔，4℃过夜，用PBS-T洗板3次，接着进行二抗反应，37℃保温2 h，用PBS-T洗板3次；进行显色反应，用BIO-RAD 680酶标仪测定D492nm值。

1.8 Western印迹检测抗体特异性

取SCIRR39-C重组抗原表位蛋白进行SDSPAGE，采用预染蛋白标准以便于检测转移效率。15 V以下恒压转移45 min，于1%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入制备的一抗Anti-SCIRR39（1∶500）室温孵育1 h，用0.1%PBST洗3次，各10 min；以封闭液稀释HRP标记的二抗（1∶2000），与硝酸纤维素膜一起于室温共孵育1 h；用0.1%PBST洗3次，各10 min；ECL试剂显色。

2 结果

2.1 Scirr39基因的克隆及鉴定

以大鼠全横断损伤脊髓的总RNA为模板，加入上下游引物，PCR扩增得到特异目的片段，1%琼脂糖凝胶电泳分析表明扩增片段长1386 bp（图1）。

2.2 GST-SCIRR39-C融合表达载体的构建

为了免疫动物制备抗体，我们将Scirr39编码区C端的1077～1383 bp（图2）克隆到pGEX-4T-2原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21（DE3），挑选阳性克隆，经过测序保证其序列正确。

2.3 GST-SCIRR39-C融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达

在30℃、0.2 mmol/L IPTG诱导条件下表达GST-SCIRR39-C融合蛋白。GST相对分子质量（Mr）为 26×103，SCIRR39-C为 11.9×103，融合蛋白为37.9×103。图3显示表达的融合蛋白Mr与理论值一致。

图1 Scirr39基因编码区的PCR扩增产物

图2 SCIRR39-C端抗原表位编码DNA片段的扩增

图3 SDS-PAGE检测GST-SCIRR39-C的表达

2.4 融合蛋白的纯化

在GE Health公司ÄKTA Prime蛋白纯化系统上进行，图4为SDS-PAGE检验纯化结果。

2.5 融合蛋白的酶切

GST-SCIRR39-C融和蛋白经凝血酶消化后，SCIRR39-C蛋白流出液及GST洗脱液如图5所示，主要蛋白条带Mr分别约为 26×103和11.9×103。

2.6 抗SCIRR39蛋白兔抗血清的ELISA效价测定

干燥后的融合蛋白溶于0.1 mol/L PBS，终浓度1 mg/mL，采用背部多点皮内注射的方法免疫大耳白兔，多次加强免疫后第10 d抽取血清，用ELISA检测抗体滴度，以免疫前抽取的兔血清为对照，其效价达到1∶104，可以取血收集血清（图6）。

2.7 Western印迹检测兔抗血清的特异性

以兔抗血清对原核表达的SCIRR39-C蛋白进行Western印迹检测，图7显示该蛋白条带可被检测到，且其相对分子质量与预期的SCIRR39-C一致，说明制备的抗血清结合性较好。

3 讨论

图4 SDS-PAGE检测GST-SCIRR39-C的纯化

图5 SDS-PAGE检测GST-SCIRR39-C融合蛋白凝血酶切结果

图6 ELISA检测抗体效价

图7 Western印迹检测Anti-SCIRR39的抗体特异性

由于SCIRR39是新近发现的大鼠RNase抑制剂（RNH）的同源蛋白[6-7]，目前尚无针对其的商业化特异性抗体，而为了研究SCIRR39在神经系统的分布及其在脊髓损伤/修复过程中可能的作用[8-10]，以至其他功能，我们要制备针对其的特异性抗体。为此，我们采用GST融合蛋白表达系统表达重组SCIRR39。该表达系统可以高效表达融合蛋白，且产物易纯化，用凝血酶切除GST也比较容易。但由于原核细胞中缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，以及在重组蛋白表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，且表达环境不同于真核细胞，无法形成正确的次级键等原因，故使得表达的融合蛋白很难折叠成正确的空间构象。我们在表达SCIRR39全长蛋白时就遇到这方面的重重困难，由于蛋白序列中含有多达32个Cys残基，很可能在表达过程中发生二硫键错配，使得我们没有得到目的蛋白。而通过降低诱导温度和IPTG浓度等方法也没有提高蛋白的可溶表达量，这种极少量的目的蛋白对于抗体制备来说是远远不够的。因此，我们选择表达抗原表位的方法制备抗体。通过抗原表位分析，选择C端359～461位103个氨基酸残基作为SCIRR39的抗原表位，免疫家兔制备多克隆抗体。经过对宿主菌的选择及诱导条件的优化，我们将构建的重组质粒诱导表达；之后用纯化的SCIRR39免疫成年日本大耳白兔，得到了针对SCIRR39的多克隆抗体[11]，该兔抗血清的ELISA效价约为1∶104，表明抗血清具有较好的特异性。SCIRR39重组蛋白多克隆抗体的成功制备，为进一步深入研究其生物学功能提供了良好的工具。

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