Carbonic Anhydrase IX在胃癌中的表达及对胃癌术后复发的影响

杨卫军，杨 霞，吴正阳，李春来，董浩林

(1.贵州省贵阳市第一人民医院 普外科，贵阳 贵州 550002；2.第三军医大学 免疫学教研室，重庆 400030；3.中国人民解放军第210医院，辽宁 大连 116001)

Carbonic Anhydrase IX在胃癌中的表达及对胃癌术后复发的影响

杨卫军1，杨 霞2，吴正阳1，李春来1，董浩林3

(1.贵州省贵阳市第一人民医院 普外科，贵阳 贵州 550002；2.第三军医大学 免疫学教研室，重庆 400030；3.中国人民解放军第210医院，辽宁 大连 116001)

目的探讨CAIX(Carbonic Anhydrase IX)在胃癌组织中的表达以及对胃癌术后复发的影响。方法采用免疫组化染色法检测CAIX在56例术后胃癌病人组织中的表达，比较不同分期的胃癌组织中CAIX表达的差异以及对术后胃癌病人术后复发率的影响。结果56例胃癌组织切片中CAIX 阳性率为85.7%；在Ⅰ～Ⅳ期的阳性率分别为40.0%、66.7%、96.8%、100%，不同分期胃癌组织中CAIX阳性表达比较有显著差异(P<0.05)；CAIX阳性者手术后1～3年的累计肿瘤复发率分别为35.4%、54.2%、66.7%，CAIX阴性者手术后1～3年的累计肿瘤复发率分别为0%、12.5%、25%，两组手术后1～3年的累计肿瘤复发率比较有显著差异(P<0.05)。结论CAIX在胃癌组织中的表达随着胃癌分期增加而增加，CAIX阳性者预后差且更容易出现术后的复发。

CAIX；胃癌；复发

实体肿瘤随着肿瘤的进展以及肿瘤血管的异质性，肿瘤内部逐渐出现缺氧或坏死区域。碳酸酐酶IX(CAIX)通过调节细胞膜内外离子和气体转运，维持细胞在缺氧环境下细胞的分裂增殖，从而维持肿瘤细胞的增殖，进一步促进肿瘤的进展[1]。胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，但CAIX在胃癌组织中的表达的研究鲜有报道。本研究采用免疫组化法检测56例胃癌中CAIX的表达，比较不同分期的胃癌组织中CAIX的表达以及CAIX阳性表达对胃癌术后复发的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 胃癌组织标本取材于重庆肿瘤医院 2009～2010年56例胃癌手术病人，年龄28～76岁，男性39例，女性17例。术前均未行放化疗以及其他抗肿瘤治疗。所有病人均行D2胃癌根治术，术后记录病理类型、临床分期、组织学分级。胃癌病人的TNM分期依照美国癌症联合委员会(AJCC)制定的胃癌TNM分期第七版标准判定。肿瘤浸润的深度分组中，浸润至黏膜或黏膜下层(T1)2例，浸润至固有肌层(T2)7例，浸润至浆膜下疏松组织(T3)40例，侵及浆膜或邻近结构(T4)7例；淋巴结转移的分组中，无淋巴结转移(N0)13例，有1～2个区域淋巴结转移(N1)26例，有3～6个区域淋巴结转移(N2)16例，有超过7个区域淋巴结转移(N3)1例；TNM分期组中，Ⅰ期5例，Ⅱ期12例，Ⅲ期31例，Ⅳ期8例；组织学分级组中，高分化腺癌7例，中分化腺癌13例，低分化腺癌36例。所有病人术后均行XELOX方案化疗6个周期。术后通过住院、门诊复诊以及电话联系方式对病人随访3年。

1.1.2 CAIX 抗体SP免疫组化试剂盒购自abcam公司。

1.2 方法 取术后胃癌组织经10%甲醛固定，石蜡包埋切片。常规脱蜡至水，严格按试剂盒说明书操作，3%过氧化氢避光孵育 10 min消除内源性过氧化物酶；PBS 冲洗，微波抗原修复10 min，滴加血清工作液，室温孵育 15 min封闭非特异性抗原；滴加一抗后置入冰盒4 ℃过夜。用 PBS 代替一抗作阴性对照。 PBS 洗 3 次，滴加二抗，室温孵育30 min，PBS洗涤，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15 min，PBS洗涤，DAB 显色，蒸馏水

终止，苏木素复染，酒精梯度脱水、二甲苯透明，树胶封片。

1.3 结果判定 CAIX表达于细胞质，呈棕黄色或黄褐色。CAIX阳性标准[2]:阴性(-)为肿瘤组织完全不着色或阳性细胞数≤10%；阳性(+)为肿瘤组织阳性细胞数>10%。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0 统计软件对数据进行分析，计数资料比较采用2检验及Fisher精确概率法，P<0. 05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CAIX在胃癌组织中的表达情况 本组56例胃癌组织中，CAIX阳性48例，阳性率为85.7%。T1-T4的阳性率分别为0.0%、85.7%、85.7%、100.0%，T4期的阳性率明显高于T0-T3期(P<0.05)；N0-N3的阳性率分别为46.2%、96.2%、100.0%、100.0%，N2期及N3期的阳性率明显大于N0及N1期(P<0.05)；Ⅰ～Ⅳ期的阳性率分别为40.0%、66.7%、96.8%、100.0%，Ⅲ、Ⅳ期的阳性率明显高于Ⅰ、Ⅱ期(P<0.05)。CAIX在高分化胃癌、中分化以及低分化胃癌组织中的阳性率为85.7%、84.6%、86.1%，CAIX阳性表达无明显差别(P>0.05，见图1、表1)。

注：A：CAIX在胃癌组织中呈阴性表达；B：CAIX在胃癌组织中呈阳性表达。 图1 CAIX在胃癌组织中的表达(×400)

2. 2 CAIX 对胃癌术后复发的影响 本组56例胃癌病人中，术后1年肿瘤复发17例，复发率为30.4%；术后2年累计肿瘤复发27例，累计复发率为48.2%；术后3年累计肿瘤复发34例，累计复发率为60.7%；CAIX阳性48例，CAIX阴性8例，CAIX阳性病人术后1年、2年、3年的累计复发率明显高于CAIX阴性病人(P<0.05，见表2)。

表1 CAIX在56例胃癌组织中的表达

比较变量CAIX-+肿瘤浸润的深度T120T216T3535T407P<0.05淋巴结侵袭转移N076N1125N2016N301P<0.05TNM分期I32II48III130IV08P<0.05组织学分级高分化16中分化211低分化531P>0.05

表2胃癌组织中CAIX表达对术后累计复发率的影响

组别术后1年内复发(例)术后2年内复发(例)术后3年内复发(例)CAIX阳性17/48(35.4%)26/48(54.2%)32/48(66.7%)CAIX阴性0/8(0.0%)1/8(12.5%)2/8(25.0%)

注：P<0.05。

3 讨论

本研究发现，胃癌浸及胃壁的黏膜固有层及黏膜下层时，免疫组化检测CAIX呈阴性表达，随着肿瘤浸润的深度增加，CAIX出现阳性表达递增，当肿瘤浸及胃浆膜层，CAIX呈100%阳性表达。提示胃癌组织中CAIX表达与肿瘤浸润的深度相关(P<0.05)。56例胃癌病人中，无淋巴结转移者与有淋巴结转移者的CAIX表达有明显区别(P<0.05)，当转移的淋巴结超过7枚时，胃癌组织中CAIX呈100%阳性表达。在研究不同分期的胃癌组织中CAIX表达发现，随着肿瘤分期的增加，CAIX阳性表达随之而增加，且各个不同分期的CAIX阳性率比较有显著差异(P<0.05)。上述结果提示CAIX在胃癌组织中的表达与肿瘤浸润的深度、淋巴结转移以及肿瘤分期相关。但是CAIX的表达与胃癌组织的组织学分级的相关性尚不明确。

研究表明CAIX的表达与肿瘤的乏氧代谢密切相关，CAIX主要在实体癌的缺氧区表达[6]。本次研究结果提示CAIX在胃癌中的表达与肿瘤浸润的深度、区域淋巴结的转移以及肿瘤的临床分期成正比，表明随着胃癌的进展，胃癌组织缺氧程度随之增加。CAIX能反映胃癌组织的缺氧程度，因此，CAIX在胃癌组织中的表达是胃癌病人预后不良的标志，这与国外研究结果相吻合[7-10]。在比较胃癌组织中CAIX阳性组与阴性组的手术后1～3年的肿瘤累计复发率的研究发现，CAIX阴性组的术后1～3年胃癌累计复发率明显低于CAIX阳性组。提示CAIX阳性病人肿瘤分期较晚以及手术前已存在淋巴、血液转移，这与本次研究发现CAIX在胃癌组织中的表达与肿瘤浸润的深度、淋巴结转移以及肿瘤分期相关一致。

综上所述，胃癌组织中CAIX的阳性表达表明了胃癌的进展，并能反应胃癌组织的缺氧情况，是胃癌病人预后不良的指标。对CAIX在胃癌组织中表达的研究为胃癌的靶向治疗提供了新的思路[11]，但是胃癌的发生、发展是一个多阶段、多基因参与的复杂过程，CAIX在胃癌组织中表达的具体影响尚需大量的临床研究以及长期的随访来进一步证实。

[1] Giatromanolaki A，Koukourakis M I，Sivridis E，et al. Expression of hypoxia-inducible carbonic anhydrase -9 relates to angiogenic pathways and independently to poor outcome in non -small cell lung cancer[J].Cancer Res，2001，61(21) :7992-7998.

[2]彭启宇, 温儒民, 薛松. HIF-1α与CAIX 在肾细胞癌中的表达及临床意义[J]. 徐州医学院学报，2008,28(4)：229-231.

[3]Barnea G, Silvennoinen O, Shaanan B, et al. Identification of a calbonic anhydrase-like domain in the extracellular region of RPTP gamma defines a new subfamily of receptor tyrosine phosphatases [J]. Mol Cell Biol, 1993, 13(3): 1497-1506.

[4]Ivanov S, Liao S Y, Ivan ova A, et al. Expression of hypoxia inducible cell-surface transmembrane carbonic anhydrases in human cancer [ J]. Am J Pathol, 2001, 158(3): 905- 919.

[5]A C Klimowicz, P Bose, S K Petrillo, et al. The prognostic impact of a combined carbonic anhydrase IX and Ki67 signature in oral squamous cell carcinoma [J]. Br J Cancer , 2013, 109(7):1859-1866.

[6]Kaluz S, Kaluzová M, Stanbridge E J. The role of extracellular signal-regulated protein kinase in transcriptional regulation of the hypoxia marker carbonic anhydrase IX[J]. J Cell Biochem, 2006, 97:207-216.

[7]Trastour C, Benizri E, Ettore F,et al.HIF-1alpha and CAIX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome[J].Int J Cancer,2007,120:1451-1458.

[8]Van den Eynden G G, Van der Auwera I, Van Laere S J,et al. Angiogenesis and hypoxia in lymph node metastases is predicted by the angiogenesis and hypoxia in the primary tumour in patients with breast cancer [J]. Br J Cancer, 2005, 93:1128-1136.

[9]Hussain S A, Ganesan R, Reynolds G,et al.Hypoxia-regulated carbonic anhydrase IX expression is associated with poor survival in patients with invasive breast cancer [J]. Br J Cancer, 2007,96:104-109.

[10]Brahimi-Horn M C, Pouyssegur J. The hypoxia-inducible factor and tumor progression along the angiogenic pathway [J]. Int Rev Cytol, 2005, 242:157-213.

[11]Paul C McDonald, Jean-Yves Winum, Claudiu T,et al. Recent Developments in Targeting Carbonic Anhydrase IX for Cancer Therapeutics [J]. Oncotarget, 2012, 3(1): 84-97.

SignificanceofcarbonicanhydraseIX(CAIX)expressioningastriccarcinomaandtheinfluenceontherecurrenceofgastriccancerafteroperation

Yangweijun1,Yangxia2,Wuzhengyang1，Lichunlai1，Donghaolin3

(1. Department of Surgery, The First People’s Hospital of Guiyang,Guizhou Guiyang 550002,China；2. Department of Immunology, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China；3. The 210th Hospital of Chinese people’s Liberation Army,Liaoning Dalian 116001,China)

ObjectiveTo explore the Carbonic Anhydrase IX (CAIX) expression in gastric cancer tissue and the effect on the gastric cancer recurrence after surgery.MethodsImmunohistochemical staining was used to detect CAIX in 56 cases of postoperative patients with gastric cancers, and comparison of CAIX expression in different stages of gastric cancer tissue was made and the postoperative recurrence of gastric cancer patients in relation with CAIX expression was onvestigated.ResultsIn 56 cases of gastric cancer tissue biopsies CAIX positive rate was 85.7%, in phase I, II, III, IV positive rate were 40.0%, 66.7%, 96.8% and 100% respectively. CAIX-positive expression in different stages of gastric cancer had significant difference (P<0.05). The patients of CAIX positive 1-year 2-year, 3-year after surgery with the cumulative recurrence rate was 35.4%, 54.2 %, 66.7%, respectivelyIn CAIX-negative patients 1 year 2-year, and 3 -year after surgery, the cumulative recurrence rates were 0 %, 12.5% , and 25%. The 1-3 years of cumulative recurrence rates in the two groups after surgery were significantly different (P< 0.05).ConclusionExpression of CAIX in gastric cancer tissue increased with the increase of the staging of gastric cancer, and CAIX positive was a poor prognostic factor and more prone to recurrence.

carbonic anhydrase IX；gastric cancer；recurrence

R735.7

A

1000-2715(2013)05-0456-04

[收稿2013-05-23;修回2013-09-17]

(编辑：谭秀荣)