NDRG1基因在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

吴晓媚，林宇静，邓 飞，王海青，黄新爱

(1.遵义医学院第五附属医院 病理科，广东 珠海 517100，2.中山大学附属第五医院 病理科， 广东 珠海 519100)

·临床医学研究·

NDRG1基因在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

吴晓媚1，林宇静2，邓 飞1，王海青1，黄新爱1

(1.遵义医学院第五附属医院 病理科，广东 珠海 517100，2.中山大学附属第五医院 病理科， 广东 珠海 519100)

目的观察NDRG1在皮肤鳞状细胞癌(SCC)中的表达情况，探讨其在SCC发生、发展中的意义。方法应用免疫组织化学染色和原位杂交技术检测NDRG1在30例SCC和10例正常皮肤中的表达。结果NDRG1蛋白及 NDRG1mRNA在SCC中呈强阳性或阳性表达，在正常皮肤中呈弱阳性或阴性表达。两者在SCC中的表达均明显高于正常皮肤，差异均有统计学意义(P<0.01)。结论NDRG l基因的高表达可能在SCC的发生、发展中发挥重要作用。

NDRG1；NDRG1mRNA；皮肤鳞状细胞癌

皮肤鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)是皮肤科常见肿瘤，近年来其发病率在许多国家呈上升趋势，目前其发病机制尚未完全明晰。研究表明对细胞增殖分裂的调控失常以及癌、抑癌基因的失常是肿瘤发生的重要原因。NDRG1 在肿瘤组织中的作用有很大争议，很多学者在NDRG1与肿瘤的发生、发展、转移和预后等方面做了很多的研究，但到目前为止，该基因的确切功能还未达成一致。目前，国内外文献少见有关NDRG1在人皮肤鳞状细胞癌中表达情况的报道。本研究通过免疫组织化学及原位杂交技术，检测NDRG1基因在SCC中的表达，探讨NDRG1在SCC发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2006年至2010年本院病理科及中山大学附属第五医院病理科资料保存完整的30例SCC作为实验组，所有标本均经组织病理学明确诊断。其中男24例，女6例，年龄63±6.5岁。高分化鳞癌25例，中分化鳞癌4例，低分化鳞癌1例。头皮2例，面部14例，下肢7例，阴茎7例，患者术前均未进行放、化疗等治疗。另选择本院外科手术取下的正常皮肤组织10例作为对照组。

1.2 主要试剂 浓缩型兔抗人NDRG1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司。NDRG1 mRNA寡核苷酸探针原位杂交试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化 采用免疫组化SP法，实验步骤严格按产品说明书进行。浓缩型NDRG1抗体的工作浓度为1∶50，以鼠肾组织作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

1.3.2 原位杂交 实验步骤按原位杂交试剂盒说明书进行。每张切片滴加20 μL含NDRG1 mRNA寡核苷酸探针的杂交液，40 ℃杂交过夜。以鼠肾组织作阳性对照，以滴加不含探针的预杂交液作阴性对照。

1.4 结果判定 NDRG1蛋白和NDRG1mRNA阳性信号定位于细胞质或细胞膜，为黄至棕褐色颗粒。判断结果参照以往文献采用半定量积分法，按阳性细胞所占的百分比与着色强度来评分：①按阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞数≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%则为4分。②按着色强度进行评分：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。取①②项评分的乘积作为染色结果的评判标准：0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)表达。用图像分析系统检测阳性染色的表达水平(阳性面积)和表达强度(光密度)。

2 结果

2.1 NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA的表达 NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA在SCC组中呈强阳性或阳性表达，在正常皮肤组中呈弱阳性或阴性表达(见图1)。NDRG1蛋白和NDRG1 mRNA在皮肤SCC中的表达水平和表达强度均明显高于正常皮肤组，对比有统计学意义(见表1、2)。

表1 NDRG1在鳞状细胞癌与正常皮肤中的表达

组 别例数NDRG1mRNA蛋白的表达PAOD正常皮肤组100．534±0．045∗∗0．401±0．034∗∗皮肤鳞状细胞癌组300．135±0．026∗∗0．266±0．024∗∗

注：PA代表阳性面积代数和/分析区域面积的比值，OD代表平均光密度,**P<0.01 vs 正常皮肤组。

表2 NDRG1mRNA在鳞状细胞癌与正常皮肤中的表达

组 别例数NDRG1mRNA蛋白的表达PAOD正常皮肤组100．037±0．029∗∗0．123±0．032∗∗皮肤鳞状细胞癌组300．631±0．056∗∗0．421±0．043∗∗

注：PA代表阳性面积代数和/分析区域面积的比值，OD代表平均光密度,**P<0.01 vs 正常皮肤组。

注：A：NDRG1蛋白在皮肤中的弱阳性表达(IHC×400);B:NDRG1在鳞状细胞癌中的强阳性表达(IHC×400);C:NDRG1 mRNA在正常皮肤中的阴性表达(ISH×400);D:NDRG1 mRNA在鳞状细胞癌中的强阳性表达(ISH×400)。 图1 NDRGI蛋白和NDRGI mRNA的表达

3 讨论

目前随着环境污染越来越严重，皮肤癌的发病率日渐增高，而由于皮肤癌的动物模型复制比较困难，所以对于皮肤癌的研究相对于其它肿瘤较少。随着对肿瘤研究的不断深入，人们试图从抑制肿瘤细胞增殖或促进凋亡两个方面去研究肿瘤发生、发展的机制。

NDRG1基因(N-myc Downstream Regulated Gene1，N-myc 下游调节基因)是一种与细胞分化相关的新基因[1]，具有调控肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞生长及转移功能，其定位于人染色体8q242，长约60kb，编码蛋白分子质量为43kDa，其蛋白质C末端区域包含特有的10个氨基酸的串联重复序列，具有高度保守性，在人体组织中广泛存在，并参与各种生理功能及胚胎的发生，与肿瘤细胞的生长、分化和转移均有关系[2-4]。NDRG1在实体恶性肿瘤中过表达的机制可能为：肿瘤细胞迅速增殖、扩张，进而引起微环境改变后，不能提供足够的氧与营养，造成缺氧状态，导致缺氧诱导基因NDRG1的表达增高。Dos Santos M等[5]通过免疫组化技术检测了103例口腔鳞状细胞癌中NDRG1的表达情况，发现在98.1%口腔鳞状细胞癌样本中呈高表达，在正常组织中呈阴性表达。Ko shiji等[6]研究显示NDRG1在结肠癌中过表达，提示NDRG1作为潜在的癌基因可能在结肠癌的发生中起重要作用，并可能与结肠癌的演进有密切关系。NDRG1在凋亡过程中也起到一定的作用。Chen等[7]发现，缺氧的滋养层细胞中NDRG1表达明显高于正常的滋养层细胞中NDRG1表达，NDRG1高表达对p53诱导的凋亡有抑制作用，从而起到保护细胞的作用。NDRG1在肿瘤生长过程中的上调可能是对缺氧状态的一种反应，基于其可能存在的保护细胞的作用，这种上调反过来可能有利于肿瘤的进一步扩增。

目前研究发现NDRG1在其它肿瘤的发生、发展中都起着一定的作用，而在皮肤鳞状细胞癌中的作用研究相对较少。本研究运用原位杂交及免疫组化二种实验方法对皮肤鳞状细胞癌中的NDRG1进行检测，结果显示NDRG1mRNA及其蛋白在皮肤鳞状细胞癌组呈强阳性表达，在正常皮肤组织呈阴性表达，两者相比有明显差异，差异有统计学意义(P<0.01)，提示NDRG1可以作为皮肤鳞状细胞癌其中一个诊断指标，NDRG1mRNA及其蛋白在正常皮肤癌变成皮肤鳞状细胞癌的过程中可能发挥了一定作用，它的表达异常可能是导致皮肤鳞状细胞癌发生的其中一个因素，而其在皮肤鳞状细胞癌发生、发展中所起的是促进肿瘤细胞的增殖还是抑制肿瘤细胞的凋亡还需进一步探讨。

NDRG1作为一种癌基因，可能是皮肤鳞状细胞癌发生发展的重要因素之一。它与肿瘤的组织分化程度、有无淋巴结转移等是否有密切相关，都有待于大样本进一步研究。皮肤鳞状细胞癌领域开展NDRG1的研究有助于进一步了解皮肤鳞状细胞癌发生、发展和演变的机制，有可能成为SCC的早期诊断的生物学指标，为研究皮肤鳞状细胞癌的发病机制、早期诊断及基因治疗提供实验理论依据。

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[2]Maruyna Y，Ono M，Kawahara A，et al.Tumor growth suppression in pancreatic cancer by a putative metastasis supp res sorgene Cap43/NDRG1 /Drg-1 through modulation of angiogene2sis[J].Cancer Res，2006，66 (12)：6233-6242.

[3]Bandyopadhyays S，Wang Y，Zhan R，et al.The tumor metastasis suppressor gene Drg-1 down - regulates the expression of activating transcription factor 3 in prostate cancer [J].Cancer Res，2006，66 (24)：11983-11990.

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[5]Dos Santos M, da Cunha Mercante A M, Nunes F D，et al.Prognostic significance of NDRG1 expression in oral and oropharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Mol Biol Rep,2012，39(12)：10157-10165.

[6]Ko shiji M，Kumamoto K，Morimura K，et al.Correlation of N-myc downstream 2 regulated gene 1 expression with clinical outcomes of colorectal cancer patients of different race/ethnicity [J].World J Gastroenterol，2007，13 (20)：2803-2810.

[7]Chen B，Nelson D M，Sadovsky Y.N- myc down-regulated gene1 modulates the response of term hum antrophoblasts to hypoxic injury[J].J Biol Chem，2006，281(5)：2764-2772.

[收稿2013-02-17;修回2013-05-21]

(编辑：谭秀荣)

SignificanceandexpressionofNDRG1inskinsquamouscellcarcinoma

Wuxiaomei1,Linyujing2，Dengfei1，Wanghaiqing1，Huangxinai1

(1. Department of Pathology, The Fifth Affiliated Hospital of Zunyi Medical College, Guangdong Zhuhai 519100, China; 2. Department of Pathology,The Fifth Affiliated Hospital of Sun YAT-SEN University, Guangdong Zhuhai 519000, China)

ObjectiveTo study the expression of NDRG1 in cutaneous squamous cell carcinoma and further investigate the role of NDRG1 in the development of cutaneous squamous cell carcinoma.MethodsThe expressions of NDRG1 mRNA and protein in 30 cutaneous squamous cell carcinomas and 10 normal skin were detected by in situ hybridization and SP immunohistochemical technique, respectively.ResultsThe positive expressions of NDRG1 mRNA and protein were shown in squamous cell carcinoma and negative expressions were detected in normal skin. The NDRG1 expression levels in squamous cell carcinoma were significantly higher than those in normal skin (P<0.01).ConclusionThe higher expression of NDRG1 might play an important role in the development of cutaneous squamous cell carcinoma.

NDRG1;NDRG1 mRNA;cutaneous squamous cell carcinoma

739.5

A

1000-2715(2013)03-0225-03

广东省珠海市卫生局资助项目(NO:2011074)。