电针治疗脑瘫机理的实验研究

赵冠雷，陈学农

(遵义医学院附属医院 针灸科，贵州 遵义 563099)

电针治疗脑瘫机理的实验研究

赵冠雷，陈学农

(遵义医学院附属医院 针灸科，贵州 遵义 563099)

目的通过检测缺氧缺血脑瘫模型幼鼠电针治疗后脑组织内乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的变化，探讨电针治疗脑瘫的作用机制。方法采用左侧颈总动脉结扎制备缺氧缺血脑瘫模型，按随机分组法分为A组假手术组、B组空白模型、C组针刺治疗组和D组电针治疗组。治疗观察10d为一疗程，疗程结束后断头分离脑组织取皮层、海马、纹状体，离心后取上清，用酶联免疫反应法检测AChE的含量。结果针刺、电针均能提高脑瘫模型幼鼠脑组织内AChE的活性，且电针能显著提高脑瘫模型幼鼠脑组织内AChE的活性。假手术组、电针组与模型组比较幼鼠脑组织内的AChE含量明显升高(P<0.01，P<0.05)，在海马部位针刺组与模型组比较幼鼠脑组织内的AChE含量升高(P<0.05)，在大脑皮层电针组与针刺组比较幼鼠脑组织内AChE含量升高(P<0.05)。结论电针治疗后缺氧缺血脑型脑瘫幼鼠脑组织内AChE的活性明显升高可能是电针治疗脑瘫的主要作用机制。

脑性瘫痪；针刺；电针；乙酰胆碱酯酶(AChE)

小儿脑性瘫痪简称脑瘫(children，s cerebral palsy，CP)，发病机制目前暂不明确，可能为多种综合因素造成的大脑脑室周围白质非进行性损伤，是小儿难治性神经系统疾病之一，致残率为42%～45%。针灸作为传统特色治疗方法，在治疗CP方面有着悠久的历史和丰富的经验。而电针作为传统疗法和现代科技发展的产物，丰富了针灸的治疗作用，临床效果证实对CP有着很好的治疗作用。但国内外鲜有电针治疗脑瘫机制的研究。我们通过电针对脑瘫幼鼠脑组织乙酰胆碱酯酶的影响研究，为电针治疗CP提供可能性理论机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级SD大鼠(由第三军医大学实验动物中心提供，清洁级，许可证号SCXK(渝)2007-0005)遵义医学院解剖实验室自体繁殖。选用7 d SD 幼鼠67只，饲养环境：清洁级动物实验室，温度20～25 ℃、相对湿度60%～70%，日光灯照射，定时通风，母乳喂养。

1.2 主要试剂与仪器 AChE测定试剂盒(R&D公司，10-28-029 )酶标仪(BIO-RAD，iMark，美国)。

1.3 模型的建立及分组 根据参考文献制作缺氧缺血幼鼠脑瘫模型[1]。在异氟醚吸入麻醉后，以75%酒精棉球消毒颈部皮毛，沿正中偏左切开皮肤，仔细分离左侧迷走神经和颈总动脉，并双重结扎颈总动脉，术后缝合切口，待幼鼠恢复清醒2 h后放入密闭缺氧箱，通入1L/min的8%+92%氮氧混合气体，2.5 h后取出，整个操作过程保持局部温度36～37 ℃，造模完成后将幼鼠放回鼠笼，母乳喂养。12 h后进行脑瘫行为学评定。李晓捷等[2]的脑瘫幼鼠行为学评分标准，根据随意运动、姿势异常、肌张力异常、不自主运动、倾斜板实验和平衡木实验评定造模是否成功。考虑造模死亡和不成功率较大，在体重大小相近的61只幼鼠随机选取10只为A组假手术组。去除手术过程死亡及造模不成功9只，将造模成功的42只幼鼠中选取6只及假手术组选取2只都不行任何干预，3 d后行HE染色病理切片观察脑组织变化情况。再将剩余36只随机分为BCD组：B组为空白模型组不予任何干预、C组为针刺治疗组给予普通针刺治疗和D组为电针治疗组给予电针治疗，每组12只。

1.4 HE染色病理检查 将未行任何干预的2只假手术组幼鼠及6只缺氧缺血模型幼鼠，3 d后用10%水合氯醛0.4 mL/100g腹腔注射，麻醉后打开腹腔，腹主动脉放血。断头取脑，4%的甲醛溶液固定，送遵义医学院病理科检查幼鼠脑组织受损情况。

1.5 针刺处理 参照李忠仁主编《实验针灸学》定位，根据人与动物骨度类比，选取左侧顶颞前斜线，双侧风池透翳风、右侧肩髃、外关、曲尺、合谷、髀关、伏兔、足三里、解溪。针刺组及电针组在手术后24 h开始针刺治疗。方法：自制鼠架固定，选用0.25 mm×0.25 mm安迪一次性无菌针灸针。头部穴位沿头皮呈15 ℃角平刺进针刺入约15 mm，进针后感觉针下沉紧即可，余穴快速刺入皮下至所需深度，感觉针下有沉紧感后，留针20 min。电针组留针时以G6805-D电针仪用连续波，5 Hz频率，强度以局部轻微颤动为度，通电治疗20 min；针刺组留针时以平补平泻手法间隔行针4次，200转/min，每次约2 min。模型组及假手术组每日抓空，不进行任何治疗，经治疗一疗程后处死幼鼠取材。

1.6 观测指标测定

1.6.1 取材 10%的水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉放血，快速断头，冰盘上操作，取出脑组织，剔除脑膜、血管，冰蒸馏水冲洗，分离脑皮层、海马、纹状体，称重，放入预冷1∶9的0.5%TrionX-100冰浴匀浆，离心(4 000 r/min，5 min)后取上清，置于80 ℃冰箱待测。

1.6.2 AChE活性测定 按照“AChE测定试剂盒”说明检测AChE的活性。

2 结果

2.1 脑组织HE(苏木精-伊红)染色光镜检查(见图1、2)

2.2 治疗1疗程后各组幼鼠不同部位脑组织乙酰胆碱酯酶含量比较 假手术组、电针组与模型组比较幼鼠脑组织内的AChE含量有显著差异(P<0.01，P<0.05)，在海马部位针刺组与模型组比较幼鼠脑组织内的AChE含量有差异(P<0.05)，在大脑皮层电针组与针刺组比较幼鼠脑组织内AChE含量有差异(P<0.05)(见表1)。

注：A:侧脑室周围白质；B：为皮质下白质。A和B可见组织结构较疏松，细胞排列紊乱，细胞水肿、炎细胞浸润、坏死，有散在神经元水肿、坏死，液化坏死灶内可见大量小胶质细胞增生。(↑)代表液化坏死区。 图1 术后3 d造模组幼鼠脑组织病理切片(HE×200)

注：A：皮质下白质；B：脑皮质。A和B光镜检查未见明显异常。 图2 术后3 d假手术组幼鼠脑组织病理切片(HE×200)

组 别例数皮层海马纹状体假手术组80．435±0．1380．741±0．0761．690±0．553模型组120．246±0．100▲▲0．539±0．137▲1．142±0．463▲针刺组120．336±0．120▲0．655±0．156∗▲1．324±0．471电针组120．430±0．098∗∗△0．707±0．142∗1．592±0．574∗

注：与假手术组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；与模型组比较*P<0.05，**P<0.01；与针刺组比较△P<0.05。

3 讨论

CP是出生前至生后1个月内各种原因引起的脑损伤或发育缺陷所致的运动障碍及姿势异常的一组综合征[3]。这是一种涉及运动、认知、神经等领域的小儿主要致残性疾病，主要表现为中枢性运动障碍、姿势异常及智力障碍。随着早产儿监护条件和医疗技术的进步，存活率显著增高，但随之的早产儿脑损伤发病率增加，给患者家庭及社会极大的负担。小儿脑瘫尚无满意的治疗方法，目前提倡早期综合治疗，电针在长期治疗小儿脑瘫的临床实践中得到广泛的认可，并认为是治疗的重要手段之一。

通过结扎幼鼠颈总动动脉并结合低氧环境制作缺氧缺血脑瘫模型研究新生儿脑功能障碍的价值已被实验研究广泛认可。研究认为7d大的幼鼠脑组织发育与新生儿出生时相似[4]，脑组织发育不健全，易受各种因素影响。脑组织缺血缺氧后表现呈多样性，但通常特殊性损伤在大脑中动脉及导致脑室周围白质软化，本实验HE染色病理切片检查可见脑室周围白质细胞水肿、炎细胞浸润、液化坏死灶，表明符合缺血缺氧脑瘫模型(见图1)。

AChE作为一种重要的神经递质广泛存在于周围神经系统和中枢系统中，当脑组织受损时胆碱能神经系统必然受影响。在中枢胆碱能神经主要分布在容易缺氧缺血的海马、纹状体和皮质等部位[5]，而这些部位的乙酰胆碱参与锥体外系活动、维持正常觉醒状态及学习记忆功能。AChE在一定程度上体现胆碱能系统的功能状况,当AChE活力下降时对乙酰胆碱的降解作用降低突触间隙乙酰胆碱相应增高。据报道当脑组织受损时乙酰胆碱可致兴奋性氨基酸的神经毒性作用加强，谷氨酸及天冬氨酸等兴奋性氨基酸对新生儿缺血缺氧损伤后的脑组织发育有重要作用，谷氨酸受体介导的兴奋性中毒是新生儿缺氧缺血白质损伤的重要机制，而AChE可通过降解乙酰胆碱减轻兴奋性氨基酸对神经系统的损伤[6-7]。并且AChE参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生[8]。

祖国医学认为：脑为“元神”之府，《素问·脉要精微论》指出“头者，为精明之府”。明代“张介宾”进一步指出“五脏六腑之精气，皆上升于头”。头部还是多条经脉汇聚之地，《灵枢·邪气脏腑病形》曰：“十二经脉、三百六十五络、其气血皆上于面而走空窍”。因此取头部穴位进行电针刺激，可有效激发人体的经脉气血、调整全身经脉功能。风池透翳风穴位于颈部，刺之能调和阴阳，调节脏腑组织器官的功能状态。取足阳明胃经合穴足三里(即后三里)，针之有补益后天、扶正培元之功。阳明为多气多血之经，阳明经气畅通、旺盛，则利于恢复运动功能，故配合取手足阳明经之穴肩髃，曲池、髀关、合谷、伏兔、解溪等以疏通经络，滑利关节。诸穴合用能达到益智开窍、疏经通络，调和气血的目的。

本组实验数据显示，假手术组、电针组与模型组比较大脑皮层内的AChE含量明显升高，P<0.01，在海马和纹状体P<0.05；针刺组与模型比较在海马部位AChE含量升高P<0.05，在大脑皮层和纹状体部位AChE含量虽有升高，但P>0.05，无统计学意义；电针组与针刺组比较大脑皮层部位AChE含量升高P<0.05，海马和纹状体部位AChE含量虽有升高，但P>0.05，无统计学意义。针刺、电针均能提高脑瘫模型幼鼠脑组织内AChE的活性，且电针能显著提高脑瘫模型幼鼠脑组织内AChE的活性。提示脑内AChE含量升高可能是电针治疗小儿脑瘫的机制。

[1] Ohshima M, Tsuji M, Taguchi A, et al.Cerebral blood flow during reperfusion predicts later brain damage in a mouse and a rat model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy[J].Exp Neurol,2012,233(1):481-489.

[2]李晓捷，高晶，孙仁忠.宫内感染致早产鼠脑瘫动物模型制备及其鉴定的实验研究[J].中国康复医学杂志，2004,19(12)：885-889.

[3]中华医学会儿科学会神经组.小儿脑瘫的定义、诊断条件及分型[J].中华儿科杂志,2005,43(4)：262.

[4]Stephen A. Back, M D, PhD,et al.Maturation-Dependent Vulnerability of Perinatal White Matter in Premature Birth[J].Stroke,2007,38:724-730.

[5]Elsayed M H,Hogan T P,Shaw P L,et al.Use offetal cortical grafts.inhypoxic brain injury in neonatal rat[J].Exp Neurol,1996,137:127-141.

[6]Adem Aydin,Kursad Gene,Mustafa Akhisarouglu,et al.Erythropoietin exerts neuroprotective effect in neonatal rat model of hypoxic-ischemic brian injury[J].brian& Development,2003,27:494-498.

[7]Follet P L,Deng W,Dai W,et al.Glutamate receptor-mediated oligodendrocyte toxicity in perventriventricular leukomalacia:a protective role for topriamate[J].The Journal of neuroscience,2004,24(18):4412-4420.

[8]张皑峰,欧喜超,杨朝阳,等.大鼠脊髓损伤后运动终板内乙酰胆碱酯酶和降钙素基因相关肽的变化[J].中国康复理论与实践,2008,14(11):1030-1032.

[收稿2013-01-14;修回2013-04-21]

(编辑：谭秀荣)

Experimentalstudyonthemechanismsofelectro-acupuncturetreatmentofcerebralpalsy

Zhaoguanlei,Chenxuenong

(Department of Acupuncture and Moxibustion, The Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveToinvestigate the changes of brain acetylcholinesterase(AChE) activity in cerebral palsy rat pupstreated by electro-acupuncture and explore the mechanisms of electro-acupuncture treatment in cerebral palsy.MethodsRat hypoxic and ischemic cerebral palsy model was created by left common carotid artery ligation.Rats were randomly divided into sham-operated group, model group, acupuncture group and electro-acupuncture treatment group. Ten days after treatment, rats were sacrificed and the cortex, hippocampus and striatum were separated.The AChElevel was detected by ELISA.ResultsCompared with the model group, the AChElevel was increased after acupuncture and electro-acupuncture treatment, in which the AChElevel after electro-acupuncture treatment was higher than that after acupuncture treatment. Compared with the model group,the AChElevel in cortex,hippocampus and striatum were increased in sham-operated group and electro-acupuncture treatment group(P<0.01,P<0.05). Furthermore, compared with the model group, the AChElevel in the hippocampus after acupuncture treatment was significantly increased (P<0.05). Compared with the acupuncture group, the AChElevel in the cortex after electro-acupuncture treatment was obviously increased (P<0.05).ConclusionElectro-acupuncture presents a potential benefit for hypoxic and ischemic cerebral palsy treatment and the mechanisms might be due to the increased brain AChE activity.

Cerebral palsy; acupuncture; electro-acupuncture; acetylchlinesterase

R742.3

A

1000-2715(2013)03-0214-04