产果胶酶菌株的筛选

徐 冲，关艳丽，冯 敏

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

果胶酶是指分解果胶质的酶，是含有多种组分的复合酶。果胶酶可裂解单糖之间的糖苷键，并脱去水分子，分解包裹在植物表皮的果胶，促使植物组织的分解［1］。这类酶广泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生动物和昆虫中也有发现。在微生物中，细菌、放线菌、酵母和霉菌都能代谢合成果胶酶。果胶酶在工业生产领域是一种重要的新兴酶类。据统计，目前果胶酶在全世界食品酶的销售额中占25%。主要应用于食品工业的果汁加工和果汁果酒澄清、饲料工业以及造纸工业的纸浆脱胶和麻类［2］加工。国内关于果胶酶的研究主要集中在菌种选育、生产工艺和应用工艺的改进等方面，果胶酶制剂的产量和质量还远远不能满足工业生产的需要。筛选果胶酶高产菌株仍是亟待研究的课题［3］。本研究主要针对产果胶酶菌株进行了初步筛选并对初筛菌株进行了拮抗试验。以期为后续应用研究提供基础依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 采集自辽宁省朝阳市郊果园土壤及腐烂的苹果、梨、枣等水果的腐烂部分。

1.1.2 培养基和试剂 果胶琼脂培养基［4］:K2HPO41 g，MgSO40.5 g，NaNO33 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，果胶 2 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1000 mL，pH 5.5(用于初筛);PDA培养基:用于菌株的纯化及保存;真菌种子培养基:PDA液体培养基;真菌发酵培养基:葡萄糖5 g，酵母膏1 g，蛋白胨0.5 g，蒸馏水 100 mL，pH 5.5;细菌种子培养基:LB培养基;细菌发酵培养基:K2HPO40.2 g，MgSO40.25 mg，(NH4)2SO40.2 g，MnSO4·H2O 3 g，NaCl 0.03 g，FeSO4·7H2O 0.75 mg，桔皮粉 1 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。试剂:刚果红、十六烷基三甲基溴化铵，均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 产果胶酶菌株的分离及纯化 ①菌种分离:采用稀释平板法。菌液的制备:准确称取0.5 g样品，放入已灭菌的、装有玻璃珠和50 mL无菌水的三角瓶中，置于振荡器上振荡20 min，使细胞分散，即成10－2稀释液，用移液器吸取1 mL移于装有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，即成10－3稀释液，以此类推，连续稀释成 10－4、10－5、10－6、10－7稀释液［5］。平板涂布:先将果胶琼脂培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，用移液器(枪头灭菌)吸取0.1 mL菌液接种在琼脂平板上(每个梯度设置3次重复)。用无菌刮铲将菌液涂抹均匀。将平板置于30℃培养箱倒置培养，至菌落长出后即可分离;②菌种纯化 :细菌采用平板划线法。真菌纯化采用点接，将分离平板上目的菌落的边缘菌丝用灭菌的移植针挑取小块放于培养基中央部分。

1.2.2 产果胶酶菌株的初步筛选 ①十六烷基三甲基溴化铵沉淀法:将纯化的菌株点接至果胶琼脂培养基平皿中，置于30℃的恒温培养箱中培养3 d。取出测量各菌落直径。然后在无菌条件下注入8～10 mL(已灭菌)的1%十六烷三甲基溴化铵，静置5～8 min，挑选透明圈明显且透明圈与菌落直径之比大的菌落进行复筛［6］;②刚果红染色法:将纯化的菌株点接入果胶琼脂培养基平皿中，置于30℃的恒温培养箱中培养3 d。取出测量各菌落直径。然后在培养皿中加入浓度为1 mg/mL刚果红染色液染色约40 min，倒掉刚果红染色液，用少量蒸馏水荡去薄层表面刚果红，加入蒸馏水静止脱色10 min。对光即可见明显的绛红色水解圈。挑选水解圈与菌落直径之比大于3的菌落进行复筛。

1.2.3 果胶酶产生菌的复筛 将初筛得到的菌株接种到种子瓶，30℃，200 r/min培养24 h后，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基，30℃，200 r/min培养24 h，离心取上清液测酶活。酶活测定方法:采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS法)。向15 mL具塞试管中加入0.8 mL 1.0%的果胶溶液，放置于50℃水浴中保温3 min，加入稀释后的发酵上清液0.2 mL，反应10 min，再加入DNS试剂3 mL，混合均匀，沸水浴10 min后立即冷却并定容至15 mL，于540 nm处测定吸光值。空白对照用煮沸失活的发酵上清液代替。活力单位定义:每分钟水解果胶产生1 μg还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

2 结果与分析

2.1 果胶酶产生菌的初筛结果

因果胶琼脂培养基中果胶为唯一碳源，在此培养基上可生长的菌落均有能力产生果胶酶，但因该培养基果胶用量小，无法定量判断哪种微生物产果胶酶能力强。需要对初步分离纯化的菌株进行定性筛选。根据相关文献采用了2种方法。2种方法测定分离菌株产果胶酶能力见图1和表1。通过比较可以看出采用刚果红染色法比较直观，易于观察。水解(或透明)圈与菌落直径之比大者一般有较高的果胶酶活力，可作为果胶酶产生菌的定性筛选方法。通过2种方法挑选出菌株G13、G14、G16、G24、G25 进行复筛试验。

图1 2种方法测定分离的菌落透明圈情况Fig.1 Colony transparent circle of separation and determination of two methods

表1 2种方法的比较结果Table 1 The comparison results of two methods

2.2 果胶酶产生菌的复筛结果

通过对摇瓶发酵的上清液进行了酶活测定，通过试验结果(表2)可以看出，细菌菌株G16和G25的酶活高于其他菌株，酶活力分别达到了6.37万 U/mL和6.84万U/mL。

表2 果胶酶产生菌复筛结果Table 2 Secondary screening of producing pectinase strains

3 讨论

目前我国用于规模化生产的果胶酶菌株以黑曲霉为主，生产的方式主要是固态发酵。近年来，国内外在细菌产生的果胶酶的菌种筛选、工业发酵条件优化、基因工程方面都有研究，促进了果胶酶在许多领域的应用。细菌繁殖快，液体发酵周期短，产果胶酶多呈碱性且热稳定性好，不仅能够缩短工业生产周期，而且能用于深层液态发酵生产果胶酶，比固态发酵更容易控制，同时降低生产成本，提高了产品的质量，更利于环境保护。

［1］陈清华，何永良.酶制剂在饲料生产中的应用探讨［J］.畜牧市场，2006，(10):41-43.

［2］葛菁萍，平文祥，高原，等.一株果胶酶产生菌HDYM-02的分离鉴定及系统发育分析［J］.微生物学杂志，2008，28(6):44-47.

［3］钦传光，丹·娃伦亭娜，丁诺·狄安娜，等.果胶酶高产菌种的筛选［J］.中国酿造，2000，(4):14-18.

［4］陈峰，赵学慧，赵山，等.果胶分解菌的简便筛选方法［J］.中国酿造，1998，(3):32-37.

［5］赵斌，何绍江.微生物学实验［M］.北京:科学出版社，2002:85-87.

［6］吴茜，沈雪亮，汪钊，等.碱性果胶酶菌种选育及在纺织前处理中的应用研究［J］.印染助剂，2008，25(2):25-27.