嗜麦芽寡养单胞菌D2株2套Ⅱ型分泌系统的全基因簇序列测定及分析

张 卫，毕春霞，罗 玮，秦江楠，陈 豪，王 斌，闫志勇*

(1.青岛大学医学院微生物教研室，山东 青岛 266071;2.青岛市立医院 检验科，山东 青岛 266071)

嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas mahophilia)是一种革兰阴性非发酵菌，广泛存在于自然界及人和动物体内，是目前引起院内感染的常见病原菌之一。近年来由该菌引起的感染迅速增加，而且对抗菌药物呈现多重耐药而引起人们广泛关注［1］。随着细菌蛋白质工程研究的不断深入，人们不仅关注细菌蛋白质的结构、理化特性、生物功能，更关注其分泌过程，嗜麦芽寡养单胞菌的许多生物学活性、致病性、耐药性等与其分泌各种蛋白质密切相关。作为革兰阴性细菌蛋白分泌主要途径，T2SS(TypeⅡSecretion System，T2SS)一般由分泌途径转膜蛋白基因簇为中心［2］，主要涉及12～16种蛋白，且数量具有种属特异性。T2SS在细菌的生理活动中发挥关键作用，它不仅存在于各种病原菌中，而且是攻击宿主细胞和组织的各类消化酶外排必经之路，有研究表明病原菌T2SS缺失株的毒力明显减低［3］，可见，研究细菌的分泌系统具有重要的意义。本实验室从海洋双齿围沙蚕消化道分离得到1株嗜麦芽寡养单胞菌D2株，研究发现该菌能分泌大量的 SMP蛋白(GenBank 收录号 GQ413951)［4］，据绘制出的 SMP基因结构草图分析显示，该基因与Ⅱ型分泌系统转膜蛋白基因簇(Gsp，general secretory pathway transmembrane protein)紧密串联，同时根据该基因的功能、氨基酸序列、信号肽(N'端24个氨基酸具有显著的Sec信号肽特征)等特征推测，该蛋白是依赖T2SS来实现跨膜转运的［5］。据此采用基因移步法，成功测定出了嗜麦芽寡氧单胞菌的2套T2SS，为进一步研究该菌T2SS的功能及蛋白分泌机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 嗜麦芽寡养单胞菌D2株是从海洋生物双齿围沙蚕消化道中分离获得菌株(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心收藏号为 CGMCC 1868)［4］;pMD18-T载体购自大连宝生物工程有限公司;大肠埃希菌JM109为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Promega公司;Prime-STAR HS polymerase、DNA Marker、dNTPs 等购自TaKaRa公司;质粒提取试剂盒购自Omega公司;X-gal、氨苄青霉素、IPTG等均购自Sigma公司。

1.1.3 主要仪器 梯度基因扩增仪购自德国Eppendorf公司;UVP凝胶成像分析系统购自法国VILBER LOURMAT公司;RW-0525G低温水循环仪购自美国西蒙公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计 从GenBank细菌基因组计划数据库中下载嗜麦芽寡养单胞菌K279a(NC_01094)、JV3(NC_015947)、D457(NC_017671)、R551-3(NC_011071)株的2套T2SS相关基因序列(为表述方便，分别命名为 T2SS1、T2SS2)，利用DNASTAR软件对比分析其序列的同源性，使用Primer Priemer 5.0设计引物，引物见表1。

表1 嗜麦芽寡养单胞菌D2株Ⅱ型分泌系统Gsp基因簇扩增引物Table 1 The PCR primers to the Gsp of typeⅡ secretory system in S.maltophilia D2

续表

1.2.2 细菌基因组DNA的提取 挑取D2株单个菌落接种LB液体培养基中，25℃震荡培养18 h，使用Promega基因组DNA提取试剂盒参照说明书提取。

1.2.3 PCR 扩增 采用 TaKaRa的 DNASTAR polymerase。50 μL反应体系中DNA模板(10 ng)3 μL，2 × PCR buffer 25 μL，dNTP mix 4 μL，Taq酶 0.5 μL，上下游引物各 1.5 μL。循环体系为95 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，30个循环之后延伸10 min。

1.2.4 PCR产物序列测定 PCR产物通过琼脂糖凝胶在紫外灯下切取目的片段，用凝胶回收试剂盒纯化。将纯化后的PCR产物在16℃低温循环仪中与pMD18-T Vector连接过夜，其10 μL连接体系为 buffer 5.0 μL，水 1.0 μL，载体 1.0 μL，PCR产物3.0 μL。次日转入用 CaCl2法制备的JM109感受态细胞中，并接种到含有IPTG(200 mg/mL)和 X-Gal(20 mg/mL)、Amp(100 mg/mL)的LB平板上，37℃培养过夜，在平板上挑选白色菌落接种于含有氨苄青霉素LB液体培养基内，37℃震荡培养12～18 h后，按Omega质粒提取试剂盒说明书提取。将所提取的质粒用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，阳性克隆送上海生工测序。

1.2.5 测序结果拼接及同源性分析 将先后获得的16个基因测序片段采用DNASTAR软件拼接并寻找开放读码框(Open Reading Frame，ORF)，将获取的ORF以及ORF编码的氨基酸采用DNASTAR软件对比分析各自同源性。

2 结果与分析

2.1 PCR产物纯化及阳性克隆的酶切鉴定

以嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组为模板，共获得16个PCR扩增产物，其中T2SS1基因簇扩增产物长度依次为 1191、1658、1464、1393、1636、1602、1104 bp;T2SS2 基因簇扩增产物长度依次为 1692、1339、1417、1705、1500、1380、1658、1670、968 bp，如图 1 所示。

图1 D2株T2SS基因片段的PCR扩增结果Fig.1 PCR products of T2SS

2.2 GSP基因簇序列分析及基因结构草图的绘制

将获得的16个片段先后测序后进行拼接，经DNASTAR等软件进行分析显示，所获得的序列里共包含有22个完整的开放读码框架(ORF)，在GenBank中进行Blast比对证实分别为T2SS1或T2SS2的组成基因，并获得GenBank收录号，其中T2SS1的11个ORF分别为GspF(GU377212)、E(HM151387)、D(JQ070336)、M(JQ070343)、L(JQ070342)、K(JQ070341)、G(JQ070335)、J(JQ070338)、L(JQ070339)、H(JQ070340)、C(JQ070337);T2SS2的的11个ORF分别为GspE(KF234409)、F(KF234410)、G(KF234411)、H(KF234412)、I(KF2344113)、J(KF234414)、K(KF234415)、L(KF234416)、M(KF234417)、N(KF234418)、D(KF234419)。采用生物信息学技术分析后发现，T2SS1基因簇中有D2蛋白酶基因和一个未知基因序列的插入;T2SS2串联成簇，共10656 bp，中间无其他基因插入。嗜麦芽寡养单胞菌D2株2套T2SS的基因结构草图如图2所示(图2A、B)。

图2 嗜麦芽寡氧单胞菌D2株T2SS1、T2SS2基因簇结构草图Fig.2 The draft of T2SS1 and T2SS2 gene clusters of S.maltophilia D2

2.3 Gsp基因的同源性比较

将T2SS1和T2SS2的基因簇序列使用wibur-Lipman法，蛋白序列使用Lipman-pearson法做对比，发现2套T2SS的E基因同源性相比其他基因簇的同源性要高，其基因和氨基酸同源性均在50%以上，其他基因簇序列在20% ～50%之间不等。具体对比结果如表2所示。

表2 D2株2套T2SS基因簇的相应基因的对比分析Table 2 The Comparison and analysis the corresponding 2 T2SSs gene clusters in D2

将上述22个完整的ORF在Pubmed上运用Blast分析发现，T2SS1的基因簇序列与K279a的对应蛋白基因序列同源性较高，最高为97%，与R551-3的相应蛋白基因序列同源性均能达到80%以上，最高为99%。T2SS2的氨基酸序列与K279a及R551-3同源性均能达到85%以上，具体见表3和表4。

通过上述比较发现，嗜麦芽寡养单胞菌D2株各基因簇序列均与同种属细菌的同种属对应基因簇亲缘关系最近，而与假单胞菌属同种蛋白亲缘关系相对较近，与其他种属同种蛋白的亲缘关系较远。

表3 D2株与其他菌株的T2SS1基因簇及其氨基酸同源性分析Table 3 The homology analysis of gene clusters and its amino acid of T2SS1 between D2 strain and other strains

续表

表4 D2株与其他菌株T2SS2基因簇及其氨基酸同源性分析Table 4 The homology analysis of gene clusters and its amino acid of T2SS2 between D2 strain and other strains

3 讨论

本研究室2004年从海洋生物双齿围沙蚕消化道内分离得到1株嗜麦芽寡氧单胞菌D2株，能大量胞外分泌SMP蛋白。前期研究发现SMP蛋白完整编码序列前有一个跨膜的Sec信号肽，且与T2SS的Gsp基因簇串联在一起，据此推测D2株SMP蛋白高效胞外分泌机制可能与T2SS密切相关。在所有蛋白分泌系统中，T2SS与细菌的致病性和耐药性关系密切，该系统是在1993年产酸克雷伯菌分泌支链淀粉酶时被发现，后来发现它是革兰阴性菌的常规分泌途径［6］。以前认为细菌体内只有 1套 T2SS，然而自 2002年Geneviève Ball发现铜绿假单胞菌PAO1株有2套Ⅱ分泌系统［7］，随后研究人员相继发现菊欧杆菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、青枯菌、小肠结肠炎耶尔森菌、产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)的某些株中也具有2套Ⅱ型分泌系统［8］。

本研究发现，嗜麦芽寡养单胞菌D2株也存在2套T2SS(分别命名为T2SS1和T2SS2)，进一步对测定出的2套T2SS序列运用生物信息学软件对比分析显示，T2SS1和T2SS2各有11个GSP蛋白的开放读码框。通过绘制基因结构草图显示，虽然D2株的2套GSP基因簇的基因种类和数量相同，但是各基因在基因簇中的排列顺序不同;此外，T2SS1的基因簇中插入了SMP基因和一段未知基因的序列，相对于基因簇紧密串联的T2SS2来说是一个显著差别。对比发现2套分泌系统之间有一定的同源性，GspE的基因序列同源性为68%，氨基酸同源性为51%，其次为GspJ的氨基酸同源性为38%，其他基因簇氨基酸同源性为15%～38%，该结果与铜绿假单胞菌XcpT和HxcT的同源性具有一定的相似性［9］，提示2套T2SS的功能不完全相同。

T2SS1的基因簇数目一般为12～16个，但是D2株却只有11个基因簇，与野生黄杆菌属Gsp基因簇比较，该菌株缺乏XpsO蛋白(在其他种属中称为GspA)。Ⅱ型分泌系统中，GspA与GspG、GspH、GspI、GspJ及GspK蛋白发挥同样的功能，共同参与菌毛蛋白的组装，有些种属中没有编码GspA的基因［10］。D2株的T2SS2基因簇数目变异较大，与同种属的K279A、R551-3相比，数量上一样，却比铜绿假单胞菌PAO1株多了6个基因，分别是 GspE、F、L、M、N、D，比小肠结肠炎耶尔森多了GspH、M、N却少了GspC。比较分析各基因簇的基因及相应氨基酸序列发现，T2SS的基因簇有明显的种属特异性，D2株各Gsp基因序列与K279a及R551-3 Gsp相应基因序列的同源性均在82%以上，而氨基酸序列同源性均在97%以上，有的甚至完全相同。与T1SS相比，T2SS2的Gsp基因序列和K279a及R551-3的基因序列同源性稍低，基因序列同源性最高为98%，氨基酸序列最低为85%。2套T2SS与铜绿假单胞菌相比其同源性均有所下降，且T2SS2比T2SS1下降更为明显，与不同科的小肠结肠炎耶尔森菌和霍乱弧菌相比其同源性均较低。

本研究获得了嗜麦芽寡养单胞菌T2SS的基因序列，从而为进一步研究该菌的蛋白的分泌机制奠定基础，也为从基因和蛋白水平上在嗜麦芽寡氧单胞菌的生理、功能、致病性、耐药机制、活性物质的开发、生物工程改造和利用等领域的深入研究提供更多参考。

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