白藜芦醇对高脂饮食去卵巢肥胖大鼠海马组织脑源性神经营养因子水平的影响*

苗玉连, 武传龙， 刘金波， 江 蓓， 张晓黎△

(山东大学齐鲁医院 1内分泌科， 2肾内科, 山东 济南 250012)

白藜芦醇对高脂饮食去卵巢肥胖大鼠海马组织脑源性神经营养因子水平的影响*

苗玉连1, 武传龙1， 刘金波1， 江 蓓2， 张晓黎1△

(山东大学齐鲁医院1内分泌科，2肾内科, 山东 济南 250012)

目的探讨去卵巢联合高脂饮食诱导的肥胖大鼠海马组织中脑源性神经营养因子(BDNF)、雌激素受体α (ERα)和雌激素受体β (ERβ) 表达的变化，同时观察白藜芦醇对这些改变的影响。方法50只3月龄雌性Wistar大鼠随机分为5组：假手术普通饮食对照(C)组、假手术高脂饮食(H)组、单纯去卵巢(O)组、去卵巢高脂饮食(O+H)组和白藜芦醇(40 mg·kg-1·d-1)+去卵巢高脂饮食(O+H+R)组。3月后抽取股动脉血检测血清雌二醇(E2)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量；实时荧光定量PCR法检测海马BDNF、ERα和ERβ mRNA表达，蛋白免疫印迹法及ELISA法分别检测海马BDNF蛋白含量。结果与C组比较，H组大鼠血清TC和LDL-C含量升高，海马BDNF水平显著降低(P<0.05或P<0.01)，O组大鼠血清E2水平降低，TC含量升高，海马BDNF 水平及ERα、ERβ mRNA表达均明显下降(P<0.05或P<0.01)；O+H组大鼠血清TC含量升高，HDL-C水平降低，海马BDNF 水平降低，与C组、H组和O组比较均有显著差异(P<0.05或P<0.01)，海马ERα和ERβ mRNA表达下降，与C组和H组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)；O+H+R组大鼠血清E2水平升高，TC含量降低，海马ERα和ERβ mRNA表达水平及BDNF含量均明显增加，与O+H组比较有显著差异(P<0.05或P<0.01)。结论去卵巢联合高脂饮食显著降低大鼠海马ERα和ERβ mRNA表达及BDNF水平，而白藜芦醇能够明显改善绝经后肥胖大鼠的血脂水平，上调海马ERα和ERβ mRNA表达，增加海马BDNF水平。

卵巢切除术； 高脂饮食； 肥胖； 海马； 脑源性神经营养因子

绝经后女性人群，雌激素水平降低，脂代谢发生紊乱，大量脂肪沉积，容易出现肥胖或有肥胖倾向[1]。肥胖是认知缺陷的独立危险因素，肥胖个体认知功能下降[2]。研究发现去卵巢或长期给予高脂饮食的肥胖动物均出现认知功能的下降，同时伴有海马区神经元相应的病理学改变，而这些缺陷与海马脑源性营养性神经因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)水平的下降密切相关[3-7]。白藜芦醇是一种植物雌激素，具有调节脂代谢及神经保护的作用[8]。动物研究证实白藜芦醇能够改善高脂饮食诱导的肥胖大鼠认知功能的缺陷[9],增加海马BDNF的表达[10]，但白藜芦醇对去卵巢联合高脂饮食大鼠海马组织BDNF水平的影响及机制尚不清楚。本实验采用高脂喂养去卵巢大鼠的方法复制绝经后肥胖模型，通过观察各组大鼠血清中血脂水平、海马雌激素受体α(estrogen receptor α, ERα)、雌激素受体β(estrogen receptor α, ERβ)和BDNF mRNA 的表达水平及BDNF蛋白含量等指标的变化，探讨白藜芦醇对绝经后肥胖大鼠海马组织BDNF水平的影响及机制。

材 料 和 方 法

1动物

健康3月龄Wistar雌性大鼠50只，体重(200±12)g，由山东大学实验动物中心提供。动物饲料分为去豆类普通饲料和高脂饲料，其中高脂饲料成分为：78.9%基础饲料，1%胆固醇，0.1%胆酸盐，10%黄粉，10%猪油，均购于北京科奥协力饲料有限公司，质量合格证：SCXK(京)2009-0012。

2主要试剂

白藜芦醇购于Sigma；大鼠雌二醇(estradiol, E2)放免试剂盒购于天津九鼎医学生物工程有限公司；蛋白酶抑制剂混合物cocktail为Amresco产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天公司；兔抗大鼠BDNF抗体购于Abcam，小鼠抗大鼠β-actin抗体和HRP 标记的Ⅱ抗均购于中杉金桥公司；RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix EX TaqTM均为TaKaRa产品；大鼠BDNF ELISA试剂盒购于北京科盈美生物科技有限公司；其余试剂均为国产分析纯；所用引物由济南博尚生物技术有限公司根据设计合成，见表1。

表1 引物序列

3方法

3.1动物处理 50只Wistar雌鼠分笼适应性喂养7 d，喂养环境：相对湿度为45%～60%，温度为22 ℃～26 ℃，每天给予12 h(7：00～19：00)光照，12 h(19：00～次日7：00)黑暗。7 d后按体重随机分成5组，每组10只：假手术普通饮食对照(C)组、假手术高脂饮食(H)组、单纯去卵巢(O)组、去卵巢高脂饮食(O+H)组和白藜芦醇+去卵巢高脂饮食(O+H+R)组。各组大鼠手术前禁食12 h, 0.3%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位固定、备皮、消毒，无菌操作行双侧卵巢切除术，C组和H组大鼠仅切除双侧卵巢周围少量脂肪组织(体积与卵巢相近)。

3.2饲料喂养与药物干预方法 C组及O组给予去豆类普通饲料，其余3组均给予足量的去豆类高脂饲料，自由饮水。去卵巢手术后7 d，白藜芦醇干预组给予1%羧甲基纤维素钠溶液配制的白藜芦醇混悬液(40 mg·kg-1·d-1)灌胃，其余4组给予相应剂量的1%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。每周称量体重，根据大鼠体重变化调整用药剂量，连续喂养3个月。

3.3标本采集 3个月后，排除手术或感染等因素死亡的大鼠，每组剩余大鼠7～9只，在末次灌药并禁食12 h后，称量体重，0.3%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，完全麻醉大鼠后取股动脉血5 mL, 3 000 r/min 4 ℃离心15 min ,取上清分装于相对无菌的EP管中，-80 ℃冰箱保存。相对无菌条件下，在冰上将大鼠开颅取脑，迅速分离两侧海马组织，放于无菌冻存管中，液氮保存。

3.4大鼠血清E2、总胆固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量测量方法 放免法检测血清E2水平；酶光度比色法测定血清中TC和TG含量；直接测定法检测血清LDL-C和HDL-C水平。

3.5海马组织匀浆蛋白提取及蛋白浓度测定 右侧海马组织称重后移入新的EP管中，加入相应体积PBS稀释的蛋白酶抑制剂混合物cocktail，充分研磨后冰上静置30 min，在12 000 r/min 4 ℃离心20 min，取上清分装到新的EP管中，抽取其中1 μL按BCA蛋白浓度测定试剂盒实验操作说明进行操作，用酶标仪检测吸光值，计算海马组织蛋白浓度；取蛋白样品200 μL按1∶4比例加入5×LB上样缓冲液于100 ℃煮沸变性10 min，-20 ℃保存用于蛋白免疫印迹法检测BDNF蛋白含量，其余-80 ℃条件保存用于ELISA法检测 BDNF蛋白含量。

3.6蛋白免疫印迹法检测海马中BDNF蛋白含量 取出已变性的海马组织蛋白，各孔分别加入20 μg蛋白样品，电泳，转膜，1× TBST配制的牛奶封闭液封闭1.5 h，1× TBST洗3 次，每次3 min,洗膜后分别加入小鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1∶400)、兔抗大鼠BDNF抗体(1∶100)，4 ℃孵育过夜，1× TBST洗3 次，每次15 min, 洗膜后分别加入HRP 标记的Ⅱ抗(1∶10 000)，室温孵育1 h，1× TBST洗3 次，每次15 min，ECL发光试剂盒化学发光显色。

3.7ELISA 法检测海马组织中的BDNF蛋白含量 取各组大鼠海马组织匀浆，按ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪在450 nm处检测吸光度。

3.8实时荧光定量PCR检测海马BDNF、ERα和ERβ mRNA表达 左侧海马组织称重，按RNAiso Plus试剂盒说明书分离纯化海马组织中的总RNA，分光光度法测定并计算提取的总RNA浓度及含量(冰上进行)，参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser实验操作说明将提取的RNA在反转录仪器上进行反转录，总反应体积20.0 μL，将反转录好的cDNA于LightCycler® Real-Time PCR扩增仪上按操作说明书进行cDNA的扩增，扩增程序采用两步法：预变性为95 ℃ 30 s，1个循环；之后95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，进行40个循环。PCR结束后，95 ℃ 0 s, 65 ℃ 15 s，95 ℃ 0 s，进行融解曲线分析。结果采用2-ΔΔCt方法分析。

4统计学处理

各组数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 18.0统计软件对各组实验数据进行处理，多组间比较采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1各组大鼠体重变化

图1可见，实验开始时，各组大鼠体重无显著差异(P>0.05)，给予相应干预3个月后，与C组相比，H组大鼠体重增加不明显(P>0.05)，而O组大鼠体重明显增加(P<0.01)； O+H组高脂饮食联合去卵巢大鼠体重明显增加，与H组和O组分别比较均有显著差异(均P<0.01)；与O+H组比较，去卵巢联合高脂饮食大鼠给予白藜芦醇干预后体重明显降低(P<0.05)，但仍高于H组大鼠体重(P<0.01)。

Figure 1. Changes of the body weight of the rats in various groups. Mean±SD.n=7～9.

图1各组大鼠体重变化趋势

2各组大鼠血清E2水平

由表2可见，大鼠卵巢切除3月后，O组和O+H组大鼠血清E2水平与C组相比均明显降低 (P<0.01)；但白藜芦醇干预(O+H+R)组大鼠E2水平较O+H组明显升高(P<0.05)，且与H组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

3各组大鼠血脂水平的变化

由表2可见，高脂饮食或(和)去卵巢大鼠血清中TC含量均显著增高(H组、O组和O+H组vsC组，均P<0.01)；O+H组去卵巢大鼠给予高脂饮食后TC显著升高，与O组和H组比较均有显著差异(均P<0.01)；给予白藜芦醇干预后，O+H+R组大鼠血清中TC含量比O+H组明显降低(P<0.01)。去卵巢不增加LDL-C水平(O组vsC组，P>0.05；O+H组vsH组，P>0.05)，而高脂饮食却明显增加血清LDL-C水平(H组vsC组，P<0.01；O+H组vsO组，P<0.01)；但白藜芦醇并不降低高脂喂养去卵巢大鼠血清中LDL-C含量(P>0.05vsO+H组)。去卵巢明显增加大鼠血清HDL-C水平，与C组比较均有显著差异(O组vsC组，P<0.01；O+H组vsH组，P<0.01)；而且去卵巢联合高脂饮食大鼠给予白藜芦醇干预后血清中HDL-C含量较O+H组明显升高(P<0.01)。各组大鼠血清TG水平无显著差异(P>0.05)。

表2 各组大鼠血清E2及血脂含量变化

*P<0.05，**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲▲P<0.01vsovariectomy plus normal diet (O) group;△P<0.05,△△P<0.01vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

4各组大鼠海马组织ERαmRNA的表达

由图2可见，去卵巢大鼠海马组织中ERα mRNA的表达明显低于假手术组(O组vsC组，P<0.05；O+H组vsH组，P<0.05)，而高脂饮食并不影响ERα mRNA在大鼠海马组织的表达(H组vsC组，P>0.05；O+H组vsO组，P>0.05)；给予去卵巢联合高脂喂养大鼠白藜芦醇干预3月后，海马中ERα mRNA的表达明显增加，与O+H组相比有显著差异(P<0.05)。

Figure 2. Changes of ERα mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05vscontrol (C) group;#P<0.05vssham operation plus high-fat diet (H) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

图2各组大鼠海马组织中ERαmRNA的表达

5各组大鼠海马组织ERβmRNA的表达

由图3可见，与ERα mRNA表达的变化相似，高脂饮食并不改变大鼠海马组织ERβ mRNA的表达 (H组vsC组，P>0.05；O+H组vsO组，P>0.05)；而去卵巢却明显降低大鼠海马组织中ERβ mRNA的表达水平(O组vsC组，P<0.01；O+H组vsH组，P<0.01)；但是白藜芦醇干预3月后，大鼠海马中ERβ mRNA的表达明显增加，与O+H组相比有显著差异(P<0.05)。

Figure 3. Changes of ERβ mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

图3各组大鼠海马组织中ERβmRNA的表达

6各组大鼠海马BDNFmRNA的表达

由图4可见， H组和O组大鼠给予高脂饮食或去卵巢3个月后，海马组织中BDNF mRNA的表达水平与C组比较均明显降低(P<0.05，P<0.01)；而去卵巢联合高脂饮食(O+H)组大鼠海马BDNF mRNA的表达水平明显低于单纯高脂饮食(H)组与单纯去卵巢(O)组，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.05)；与O+H组比较，白藜芦醇明显增加海马BDNF mRNA的表达(P<0.01)。

Figure 4. Changes of BDNF mRNA expression in hippocampus. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲P<0.05vsovariectomy plus normal diet (O) group;△△P<0.01vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

图4各组大鼠海马组织中BDNFmRNA的表达

7各组大鼠海马BDNF蛋白的含量

Western blotting与ELISA结果可见，与C组比较，H组和O组大鼠海马组织中BDNF 蛋白水平均明显降低(P<0.05，P<0.01)；O+H组高脂喂养联合去卵巢大鼠海马组织中BDNF 蛋白水平明显降低，与H组和O组分别比较均有显著差异(均P<0.01)；而给予去卵巢联合高脂饮食大鼠白藜芦醇干预3个月后，海马组织BDNF 蛋白水平较O+H组大鼠明显增加(P<0.05)，见图5。

讨 论

BDNF属于神经营养因子家族中的成员之一，是突触可塑性与记忆力形成过程的主要调节因子，具有维持神经元功能和再生修复及防治神经细胞退行性变的功能，大脑区域BDNF表达上调可抵御神经元的损伤，对神经元具有保护作用，而且海马的BDNF能够通过影响与阿尔兹海默病(Alzheimer disease, AD)相关的前胆碱能神经系统及突触蛋白形成过程对学习记忆功能发挥一定的作用[11]。

近年研究证实，认知功能的降低与雌激素缺乏及高脂饮食存在一定的联系，而这种联系与海马组织BDNF水平的改变有密切关系[3-7]，动物实验表明，去卵巢大鼠空间记忆能力降低，同时伴有海马BDNF水平的下降，而给予补充雌激素或植物雌激素后BDNF的降低得到纠正，大鼠的记忆能力改善[6]；高脂饮食诱导的肥胖大鼠海马脂质代谢紊乱，诱发炎症反应、氧化应激，引起BDNF的表达减少，降低海马突触的可塑性进而影响认知功能[5，7-8]。已证实，去卵巢或肥胖均会影响动物认知相关因子BDNF的改变，但2种因素联合对大鼠海马BDNF的影响未见报道，我们采用高脂喂养去卵巢大鼠的方法复制绝经后肥胖模型，实验结果发现：去卵巢联合高脂饮食组大鼠的体重显著增加，出现高脂血症，海马组织中BDNF mRNA表达及蛋白水平明显下降，说明高脂饮食联合去卵巢可导致BDNF的降低，减弱对海马的保护作用，提示失去雌激素保护后高脂饮食诱导的肥胖及代谢紊乱加重可能加剧大鼠海马认知功能的损伤。但也有学者发现给予去卵巢小鼠高胆固醇饮食9周后，雌激素合成增加，海马区胆碱能活性增加，小鼠空间认知能力提高[12]，这可能与高脂饲料中胆固醇含量的多少及喂养时间的长短有一定关系。与以往研究一致，我们也同样发现：单纯高脂饮食或单纯去卵巢大鼠均出现高胆固醇血症，海马组织中BDNF mRNA表达及蛋白含量均有明显下降，但我们还发现高脂饮食明显增加大鼠血清LDL-C水平，而去卵巢却不改变其含量。

Figure 5. Changes of BDNF protein expression in hippocampus.A: Western blotting; B: ELISA. Mean±SD.n=7～9.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (C) group;##P<0.01vssham operation plus high-fat diet (H) group;▲▲P<0.01vsovariectomy plus normal diet (O) group;△P<0.05vsovariectomy plus high-fat diet (O+H) group.

图5各组大鼠海马组织中BDNF蛋白水平

白藜芦醇是一种植物雌激素，具有类雌激素作用，近年来的研究提示白藜芦醇可以增加AD大鼠海马区淀粉样β肽(amyloid beta-peptides，Aβ)的清除能力[13]，能够通过抗氧化、抑制炎症因子的产生等途径诱导BDNF mRNA的表达起到神经保护的作用[9-10]。大脑是雌激素发生作用的重要靶器官，海马存在大量的ERα和ERβ，提示雌激素受体可能与认知功能相关。雌激素受体基因缺失鼠的海马突触可塑性降低，出现记忆缺失，补充雌激素后，雌激素通过影响ERα和ERβ的表达改善大鼠认知功能[14]，且有研究报道海马的雌激素受体与BDNF有广泛的共表达[15]，提示雌激素受体与BDNF有一定的联系。本研究结果也显示：去卵巢明显降低大鼠海马组织ERα和ERβ mRNA的表达，同时伴有BDNF水平的降低，而给予白藜芦醇干预3月后，发现高脂去卵巢大鼠E2水平升高，TC含量降低，海马组织BDNF水平明显升高，同时伴有海马ERα和ERβ mRNA表达增加，提示白藜芦醇增加高脂饮食去卵巢大鼠海马BDNF水平的机制可能与上调ERα和ERβ mRNA的表达有关，但我们的结果还发现：高脂饮食可明显降低假手术或去卵巢大鼠海马组织BDNF水平，却不影响海马ERα和ERβ mRNA表达水平，提示大鼠海马组织BDNF的水平可能还受ERα和ERβ之外其它途径的影响，但海马雌激素受体的改变对于雌激素缺乏引起BDNF的变化有一定的相关性。

综上所述，高脂喂养去卵巢肥胖大鼠雌激素水平降低，脂代谢紊乱，海马组织ERα、ERβ和BDNF mRNA的表达及BDNF蛋白含量降低；植物雌激素白藜芦醇能够升高去卵巢联合高脂饮食大鼠血清E2水平，增加海马组织BDNF的表达，其机制可能与降低大鼠体内胆固醇含量、减少海马组织脂质沉积以及增加ERα、ERβ mRNA表达有一定的相关性，但其具体机制还需进一步探讨。

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Effectofresveratrolonlevelofbrain-derivedneurotrophicfactorinhippocampusofobeseratsinducedbyovariectomyandhigh-fatdiet

MIAO Yu-lian1, WU Chuan-long1, LIU Jin-bo1, JIANG Bei2, ZHANG Xiao-li1

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofNephrology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:sallyzh66@sina.com)

AIM: To explore the effects of resveratrol on the level of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and the mRNA expression of estrogen receptor α (ERα) and estrogen receptor β (ERβ) in hippocampus of obese rats induced by ovariectomy and high-fat diet.METHODSFifty female Wistar rats, aged 3 months, were randomly divided into 5 groups: control (C) group, sham operation plus high-fat diet (H) group, ovariectomy plus normal diet (O) group, ovariectomy plus high-fat diet (O+H) group, and ovariectomy plus high-fat diet and treated with resveratrol (40 mg·kg-1·d-1) (O+H+R) group. Three months later, the blood was collected from the femoral artery to detect the serum concentrations of total cholesterol (TC), triglyceride (TG), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and estradiol (E2). The mRNA expression of ERα, ERβ and BDNF in the hippocampus was determined by real-time PCR. The protein level of BDNF in hippocampal tissues was detected by ELISA and Western blotting.RESULTSCompared with C group, the serum levels of TC and LDL-C in H group were increased, and the hippocampal level of BDNF was decreased. The rats in O group had higher concentration of serum TC, and lower levels of serum E2and the mRNA expression of ERα, ERβ and BDNF in the hippocampus than those in C group. Compared with C,H and O groups, the level of serum TC was higher, and the level of serum E2and the expression of BDNF in the hippocampus was lower in O+H group. The mRNA expression of ERα and ERβ in hippocampus was also reduced as compared with C group and H group. After treated with resveratrol, the rats in O+H+R group showed lower level of serum TC, and higher levels of serum E2, hippocampal BDNF and mRNA expression of ERα and ERβ than those in O+H group.CONCLUSIONOvariectomy combined with high-fat diet decreases the mRNA expression of ERαand ERβ and the level of BDNF in the rat hippocampus. Resveratrol improves the blood lipid metabolism and up-regulates the mRNA expression of ERα/ERβ and the level of BDNF in the hippocampus in obese rats induced by ovariectomy and high-fat diet.

Ovariectomy; High-fat diet; Obesity; Hippocampus; Brain-derived neurotrophic factor

R285

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.017

1000- 4718(2013)04- 0670- 06

2012- 11- 08

2013- 01- 31

山东省优秀中青年科学家科研奖励基金资助项目(No.BS2009YY038)；山东大学自主创新基金资助项目(No.2012TS162)；山东大学自主创新基金资助项目(No.2012TS204)

△通讯作者 Tel: 0531-82169462; E-mail: sallyzh66@sina.com