饲料添加剂百里香油中百里香酚和香芹酚含量的测定
2013-10-25动物营养与饲料科学湖北省重点实验室窦茂鑫侯永清
动物营养与饲料科学湖北省重点实验室 窦茂鑫 赵 迪 侯永清 吴 涛
百里香芳香油除能赋予食品香气以外,还具有防腐和抗氧化的作用(樊明涛和陈锦屏,2002)。百里香芳香油的主要成分是百里香酚和香芹酚,二者的含量总和是衡量百里香芳香油质量的重要指标(张知侠,2004)。本研究建立了检测饲料添加剂百里香油中香芹酚和百里香酚高效液相色谱法。
1 材料与方法
1.1 仪器 高效液相色谱仪(Waters 1525型,配Waters 2489检测器);超声波清洗器;电子天平(精度 0.0001 g)。
1.2 试剂 甲醇、冰醋酸为色谱纯;试验用超纯水;香芹酚标准品(Sigma公司,纯度 ≥ 99%);百里香酚标准品(Sigma公司,纯度 ≥99%)。
1.3 色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(2)柱(粒度为 5 μm,柱规格为 250 mm×4.5 mm);流动相:甲醇-水-冰醋酸(60∶4∶2,V∶V∶V);检测波长:274 nm,流速:1.0 mL/min,进样体积为 20 μL;柱温:30 ℃。
1.4 标准溶液的制备 精密量取香芹酚0.5 mL,置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制成香芹酚含量为1%的贮备液;精密称取百里香酚0.5 g,置于50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀释至刻度,制成百里香酚浓度为10 mg/mL的贮备液。然后用甲醇将香芹酚贮备液稀释成含量 分 别 为 0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.4 μL/mL 的标准液,用甲醇将百里香酚贮备液稀释成浓度为5.0、10.0、50.0、100.0、250.0 μg/mL 和 500.0 μg/mL的标准液。
1.5 样品溶液的制备 精密量取百里香油样品0.1 mL置于250 mL容量瓶中,加200 mL甲醇超声提取30 min,冷却后用甲醇定容,经过0.22 μm滤膜过滤后制得供试样品溶液。
1.6 加样回收实验 精密量取5份已知含量的百里香油供试样品,分别添加已知含量的香芹酚和百里香酚标准品,测定两者的回收率和精密度。
2 结果与分析
2.1 标准溶液色谱图 由图1可见,香芹酚和百里香酚得到了很好的基线分离,峰形对称,无杂质峰干扰。
2.2 标准曲线的绘制 将百里香酚和香芹酚系列浓度的标准品溶液分别取20 μL进样,测定积分值,以峰面积为纵坐标,以百里香酚和香芹酚含量为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程。
百里香酚:Y=10372X+43944,R2=0.9995;
香芹酚:Y=10138X+42475,R2=0.9993;
结果表明,百里香酚浓度为5~500 μg/mL线性关系良好,香芹酚浓度为为0.01~0.4 μL/mL也呈现良好的线性关系。
2.3 精密度实验 分别取100 μg/mL的百里香酚标准品溶液和0.1 μL/mL的香芹酚标准品溶液20 μL进样,连续进样 5次,测定峰面积(表 1)。求得百里香酚和香芹酚峰面积的RSD分别为0.64%和0.89%,说明此方法具有较好的精密度。
表1 精密度实验结果(峰面积)
2.4 重复性实验 按1.5中的方法制成的5份百里香油供试样品中百里香酚和香芹酚含量如表2和表3所示。实验测得百里香酚和香芹酚的平均含量分别为22.70%和5.12%,变异系数分别为0.86%和1.35%,说明方法重现性良好。
2.5 加样回收实验 精密量取5份已知含量的百里香油供试样品5 mL,分别置于5个50 mL容量瓶中,然后分别添加浓度为100 μg/mL百里香酚标准液和0.1 μL/mL香芹酚标准液进行测定,测得结果见表4、表5。从表4和表5可见,百里香酚和香芹酚的平均回收率为98.42%和97.81%,RSD分别为1.18%和0.90%,说明该方法回收率高。
3 小结
本研究建立了饲料添加剂百里香油中香芹酚和百里香酚的检测方法。实验分别采用甲醇、无水乙醇和95%乙醇超声提取30 min,结果表明,无水乙醇和95%乙醇提取的回收率相仿,略低于甲醇提取的回收率。因此本实验选用甲醇超声提取 30 min,采用 Diamonsil C18(2)柱分离,Waters 2489 检测器检测,以甲醇-水-冰醋酸(60∶4∶2,V∶V∶V)为流动相,结果显示,此方法香芹酚和百里香酚得到很好的基线分离,且重复性好、回收率高,可以作为百里香油中香芹酚和百里香酚的检测方法。
表2 百里香油中百里香酚含量测定结果
表3 百里香油中香芹酚含量测定结果
表4 百里香油中百里香酚回收率测定结果
表5 百里香油中香芹酚回收率测定结果
[1]樊明涛,陈锦屏.百里香芳香油及其主要成分抗氧化试验[J].西北农业学报,2002,11(1):34 ~ 36.
[2]张知侠.百里香芳香油化学成分的研究[J].西北农业学报,2004,13(3):151~153.