葡萄糖调节蛋白78促进肝硬化大鼠心肌细胞凋亡及其机制*

张丽丽， 庞 慧， 吕敏丽， 张慧英△， 贾建桃， 王黎敏， 刘 燕， 李旭炯， 李宝红， 张翠英， 赵中夫， 韩德五， JI Cheng

(长治医学院 1病理生理学教研室， 2免疫学教研室， 4机能实验室， 5生理学教研室， 6肝病研究所，山西 长治 046000；山西医科大学 3第二医院ICU， 7肝病研究所，山西 太原 030001； 8美国南加州大学Keck医学院肝病研究中心，加利福尼亚州 洛杉矶 90089)

葡萄糖调节蛋白78促进肝硬化大鼠心肌细胞凋亡及其机制*

张丽丽1， 庞 慧2， 吕敏丽3， 张慧英1△， 贾建桃1， 王黎敏4， 刘 燕5， 李旭炯5， 李宝红1， 张翠英5， 赵中夫6， 韩德五7， JI Cheng8

(长治医学院1病理生理学教研室，2免疫学教研室，4机能实验室，5生理学教研室，6肝病研究所，山西 长治 046000；山西医科大学3第二医院ICU，7肝病研究所，山西 太原 030001；8美国南加州大学Keck医学院肝病研究中心，加利福尼亚州 洛杉矶 90089)

目的探讨葡萄糖调节蛋白78/免疫球蛋白重链结合蛋白(GRP78/BiP)是否促进肝硬化大鼠心肌细胞凋亡及其发生机制。方法采用复合致病因素法建立肝硬化大鼠模型，在4周、6周和8周分别取材。实验1：取心脏称重并测量左室壁厚度，计算左室壁厚度与心脏重量比值及心脏指数。实验2： TUNEL法观察心肌细胞凋亡情况；免疫组化方法检测心肌组织中GRP78/BiP蛋白以及凋亡相关蛋白CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白/生长停滞及DNA诱导蛋白153(CHOP/GADD153)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)、核转录因子κB p65(NF-κB p65)、B细胞淋巴瘤/白血病蛋白2(Bcl-2)的表达。结果随肝硬化病程进展，左室壁厚度与心脏重量比值以及心脏指数逐渐增加，8周组增加显著(P<0.05)；心肌细胞凋亡指数、CHOP/GADD153和caspase-12阳性蛋白表达指数逐渐升高，8周组差异显著(P<0.05)；NF-κB p65和Bcl-2阳性蛋白表达指数呈一致性变化，在4周组较其它组明显增高(P<0.05)； GRP78/BiP蛋白阳性表达指数与心肌细胞凋亡指数、CHOP/GADD153、caspase-12蛋白阳性表达指数呈显著正相关，CHOP/GADD153与NF-κB p65、Bcl-2蛋白阳性表达指数呈显著负相关。结论GRP78高表达在内质网应激介导的肝硬化心肌病发病中可能发挥重要作用。

葡萄糖调节蛋白78； 内质网应激； 肝硬化心肌病； 细胞凋亡； 内毒素类

内质网应激诱导的凋亡是近年来发现的细胞凋亡途径之一。有关内质网应激在肝硬化心肌病发病中的作用国内外鲜有报道。前期研究发现，肝硬化大鼠心肌收缩和舒张功能明显降低，心肌细胞数量明显减少，间质纤维明显增加，内质网应激分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)/免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain-binding protein,BiP)在其中可能起关键作用[1-2]。由于心肌细胞是终末分化细胞，而且是心肌收缩和舒张的最基本单位，因此其数量的减少势必影响心脏功能，导致心力衰竭的发生和发展。本次研究我们首先对肝硬化大鼠心脏形态结构进行了观察，进而对肝硬化心肌病发病过程中GRP78/BiP在心肌细胞数量减少中的作用及其机制进行了探讨，旨在探索肝硬化心肌病发病的新机制，为临床防治提供理论和实践基础。

材 料 和 方 法

1材料

脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)细胞凋亡原位检测试剂盒购自凯基生物公司；GRP78/BiPⅠ抗购自Sigma；兔抗鼠核转录因子κB p65(nuclear factor-κB p65,NF-κB p65)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(caspase-12)、B细胞淋巴瘤/白血病蛋白2(B-cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及免疫组化染色试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白/生长停滞及DNA损伤诱导蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein/growth arrest and DNA damage-inducible protein 153,CHOP/GADD153)Ⅰ抗购自Santa Cruz。

2方法

2.1实验1

2.1.1模型建立 清洁级成年雄性Wistar大鼠，体重200～240 g。正常对照组动物饲以标准饲料和矿物质水，采用复合致病因素法复制大鼠肝硬化模型[3]，于4周、6周、8周分别取材。

2.1.2大鼠左室壁厚度测量及计算 不同时点动物经麻醉后摘取心脏，称重，继而于主动脉弓至心尖部下1/3处横断切开心脏，固定距离和条件进行拍照。BI-2000显微摄像系统下测量左室壁厚度(左室内膜与外膜最大距离)，计算左室壁厚度与心脏重量比值和心脏指数[心脏重量(mg)/体重(g)]，分别进行统计学分析。

2.2实验2

2.2.1模型建立及各取材时点同2.1.1。

2.2.2心肌细胞凋亡检测 采用TUNEL检测法，原理如下：心肌细胞凋亡时染色质DNA发生断裂，产生大量黏性3’-OH末端。在脱氧核糖核苷酸末端转移酶的介导下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA 3’-末端，借助生物素与亲和素的特异结合，使过氧化物酶连接至DNA断点，最后加入底物，通过DAB显色，可在光镜下观察到细胞核呈棕褐色或棕黄色着色的凋亡细胞。检测步骤按试剂盒操作说明书进行。

2.2.3心肌细胞凋亡指数的计算 应用BI-2000医学图像分析软件，每张切片随机选取10个视野(×400)，凋亡指数(apoptotic index, AI)以每个视野中凋亡细胞数占所观察心肌细胞总数的百分比表示[AI(%)=凋亡细胞数/总计数细胞数×100%]，取平均值进行统计学分析。

2.2.4心肌组织GRP78/BiP、CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κB p65和Bcl-2蛋白表达的检测

① 免疫组化SABC法染色步骤 石蜡切片常规脱蜡水化，3%H2O2室温下15 min灭活内源性酶，蒸馏水冲洗后枸橼酸缓冲液热修复抗原，PBS冲洗3次，滴加血清封闭液室温下封闭20 min，分别滴加兔源性抗CHOP/GADD153、抗caspase-12、抗NF-κB p65和抗Bcl-2Ⅰ抗，湿盒内4℃过夜，PBS冲洗后滴加生物素化山羊抗兔IgG室温下20 min，PBS冲洗，滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，室温下放置20 min，PBS冲洗后以DAB显色剂进行显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

② 阳性表达指数(positive expression index,PEI)的计算 以上蛋白主要在胞浆中表达，胞质着棕黄色者为阳性，胞浆无棕色或与背景色一致者为阴性细胞。应用BI-2000医学图像分析系统，每张切片随机选取10个视野(×400)，计数每个视野中阳性表达细胞数和细胞总数，计算各种蛋白的PEI[PEI(%)=阳性染色细胞数/总细胞数×100%]，取平均值进行统计学分析。

3统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 10.0统计分析软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)、组间LSD-t检验和Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1肝硬化大鼠心脏形态结构变化

肝硬化大鼠随病程进展左心室壁厚度与心脏重量比值及心脏指数均逐渐增加，以8周组增加最明显，与同期对照组相比差异显著，见表1。

表1 各组大鼠左室壁厚度与心脏重量比值及心脏指数

*P<0.05vscontrol.

2肝硬化大鼠心肌细胞凋亡

正常对照组的AI为(3.12±0.86)%，肝硬化4周组、6周组和8周组的AI分别为(5.82±1.27)%、(7.96±0.94)%和(16.52±1.46)%。8周组与其它3组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1. Apoptotic cells in rat myocardium (TUNEL, ×400). A： control; B： liver cirrhosis at 4 weeks； C： liver cirrhosis at 6 week； D： liver cirrhosis at 8 weeks.

图1TUNEL法检测各组大鼠心肌细胞凋亡

3肝硬化大鼠心肌组织GRP78/BiP蛋白的表达

正常对照组心肌细胞胞浆可见少量浅棕色颗粒。随病程进展，模型组阳性颗粒明显增多，染色加深。4周组、6周组和8周组的阳性表达指数分别为0.29±0.09、0.75±0.20和1.48±0.21，均显著高于正常对照组(0.07±0.06；P<0.05),见图2。

4凋亡相关分子CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表达

CHOP/GADD153、caspase-12和NF-κB p65在正常心肌组织均呈低表达。在肝硬化发病过程中，CHOP/GADD153和caspase-12的变化规律基本一致，蛋白表达均随病程进展逐渐增加，8周增加显著(P<0.05)；NF-κB p65蛋白在4周表达最高(P<0.05)，之后逐渐下降，但在8周仍高于正常对照水平；Bcl-2蛋白在4周表达最高，6周组和8周组依次降低，各组之间比较均有显著差异(P<0.05)，见图3、表2。

Figure 2. Expression of GRP78 protein in rat myocardium (immunohistochemical staining,×400). A: control； B: liver cirrhosis at 4 weeks； C: liver cirrhosis at 6 weeks； D: liver cirrhosis at 8 weeks.

图2各组大鼠心肌GRP78蛋白表达

Figure 3. Expression of CHOP/GADD153,caspase-12,NF-κB p65 and Bcl-2 proteins in rat myocardium (immunohistochemical staining,×400).

图3各组大鼠心肌CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表达

表2 CHOP/GADD153、caspase-12、NF-κB p65和Bcl-2蛋白的PEI值

*P<0.05vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vs4 weeks;△P<0.05vs6 weeks.

5相关性分析

GRP78/BiP蛋白表达与凋亡指数、CHOP/GADD153及caspase-12进行相关分析，相关系数分别为0.769(P<0.01)、0.613及0.704(均P<0.05),呈显著正相关。CHOP/GADD153与NF-κB p65和Bcl-2蛋白表达进行相关分析，其相关系数分别为-0.628和-0.583(均P<0.05),呈显著负相关。

讨 论

CHOP/GADD153是内质网应激促凋亡途径中的重要信号分子[4],过度或持续的内质网应激会启动细胞的凋亡程序。我们发现，CHOP/GADD153蛋白在正常心肌组织的表达微弱，而随肝硬化病程进展逐渐增强，8周组表达最显著，与GRP78/BiP的变化规律基本一致，且二者之间的变化呈显著正相关，说明内质网应激促凋亡途径中CHOP/GADD153的激活促进了心肌细胞的凋亡。目前认为CHOP/GADD153的促凋亡机制可能为：(1)直接激活下游的GADD34和TRB3，促进细胞死亡；(2)促进内质网氧化酶1α活化，激活内质网钙通道，使Ca2+流入胞浆增加，启动下游凋亡途径；(3)通过调节Bcl-2蛋白家族发挥作用[4-6]。Bcl-2家族成员不仅存在于线粒体上，也定位于内质网膜和胞浆中；业已证实内质网应激时CHOP/GADD153蛋白可以通过直接抑制Bcl-2表达从而削弱其抗凋亡功能[5]。我们发现，随肝硬化病情进展心肌组织中Bcl-2蛋白表达先增强后减弱，很可能与CHOP/GADD153蛋白表达增加有关。CHOP/GADD153还可诱导Bax和Bak构象变化和寡聚化，导致内质网膜完整性破坏、Ca2+外流，使胞浆内Ca2+浓度增高。Ca2+除了参与激活caspase-12以外，还可诱导线粒体PTP孔开放、细胞色素C释放、凋亡执行蛋白caspase-3活化[5,7]，最终导致细胞死亡。本项研究发现，肝硬化大鼠心肌细胞凋亡指数随病程进展逐渐增高，说明凋亡是引起心肌细胞数量减少的重要原因，也是肝硬化心肌病心脏形态和功能变化的基本机制；可见，在肝硬化发生发展过程中CHOP/GADD153是内质网应激促凋亡途径的重要信号分子，而GRP78/BiP是该事件发生的关键性调节蛋白。

具有免疫和抗凋亡作用的转录因子NF-κB在内质网应激引起凋亡中的作用不容忽视。我们观察到在肝硬化病程进展中NF-κB p65和Bcl-2表达在4周时最高，之后逐渐减弱，与CHOP/GADD153蛋白表达的变化方向相反。相关分析显示，肝硬化8周时NF-κB p65和Bcl-2分别与CHOP/GADD153蛋白的高表达呈显著负相关。NF-κB的活化在病变早期可能起到了细胞保护作用，后期CHOP/GADD153表达增强，削弱了NF-κB的抗凋亡作用。文献报道，早期的内质网超负荷反应(endoplasmic reticulum overload response,EOR)可激活NF-κB[8]，早期磷酸化的PERK也可促进NF-κB的表达增加[9]，NF-κB可正向调节抗凋亡蛋白Bcl-2，从而激活细胞促生存途径[9-10]，CHOP/GADD153可直接抑制Bcl-2的表达[5]。因而我们认为，内质网应激发生时先后激活了GRP78、NF-κB和CHOP/GADD153，NF-κB活化在内质网应激早期可能有重要的细胞保护作用，而在过度或持续的内质网应激时则通过促凋亡作用的加强和抗凋亡作用的减弱导致了心肌细胞凋亡。

Caspase-12是内质网应激启动凋亡的另一重要信号分子[11]。生理情况下caspase-12与GRP78/BiP形成复合体以无活性状态定位于内质网外膜，过度应激时二者解离，形成有活性的caspase-12[11]。Caspase-12也可以无活性形式与TNF受体相关因子2(TNF receptor-associated factor 2,TRAF2)形成稳定的复合物，内质网应激时游离的肌醇必需酶1与TRAF2形成复合物促进了caspase-12的裂解、活化[12]，是TNF诱导细胞凋亡的重要机制[13]。Caspase-12一经活化，将相继激活caspase-9和caspase-3，导致凋亡发生。以上事实证明caspase-12的活化是内质网应激诱导细胞凋亡的又一关键因素。我们发现，随肝硬化病程进展心肌组织caspase-12蛋白表达逐渐增强，至8周组表达最显著，而且与表达逐渐增高的GRP78/BiP蛋白呈显著正相关，提示在大鼠肝硬化心肌病发病过程中，活化的caspase-12也是心肌细胞凋亡的重要调节分子。

心肌重构是病理情况下机体调动各种抗损伤因素对损伤心肌进行修复的结果，心肌细胞凋亡必然导致心肌的重构。临床上，肝硬化心肌病患者的心脏结构改变通常发生在左心，表现为左心房壁变薄、腔增大和左室肥厚及腔增大[14]。本项研究中大鼠左室壁厚度与心脏重量比值增加以及心脏系数的增加，以及前期发现的心肌间质纤维增加[2]均充分说明肝硬化大鼠发生了心肌的重构。引起心肌重构的机制比较复杂，本模型中肠源性内毒素血症及其诱导产生的以TNF-α为主的一系列因子以及GRP78/BiP高表达可能在心肌重构中发挥重要作用[15]，其确切作用机制有待进一步深入探讨。

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Glucose-regulatedprotein78promotecardiomyocyteapoptosisinlivercirrhoticrats

ZHANG Li-li1, PANG Hui2, LÜ Min-li3, ZHANG Hui-ying1, JIA Jian-tao1, WANG Li-min4, LIU Yan5, LI Xu-jiong5, LI Bao-hong1, ZHANG Cui-ying5, ZHAO Zhong-fu6, HAN De-wu7, JI Cheng8

(1DepartmentofPathophysiology,2DepartmentofImmunology,4FunctionalIntegrativeLaboratory,5DepartmentofPhysiology,6InstituteofHepatology,ChangzhiMedicalCollege,Changzhi046000,China;3ICUoftheSecondHospital,7InstituteofHepatology,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;8ResearchCenterforLiverDisease,KeckSchoolofMedicine,UniversityofSouthernCalifornia,LosAngeles,CA90089,USA.E-mail:zhanghy2001@163.com)

AIM: To explore the cardiomyocyte apoptosis induced by glucose-regulated protein 78/immunoglobulin heavy chain-binding protein (GRP78/BiP) in liver cirrhotic rats and its mechanism.METHODSThe liver cirrhotic rat model was established with multiple pathogenic factors, and sampled at the time points of 4 weeks, 6 weeks and 8 weeks. In experiment 1, the heart was collected and weighed, the thickness of the left ventricular wall was measured, and the ratios of the left ventricular wall thickness to the heart weight, and the heart weight to the body weight were calculated. In experiment 2, TUNEL was used to detect the apoptotic cardiomyocytes,and the protein levels of GRP78/BiP, CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein/growth arrest and DNA damage-inducible protein 153 (CHOP/GADD153), caspase-12, nuclear factor-κB p65 (NF-κB p65) and B-cell lymphoma/leukemia-2 (Bcl-2) in the myocar-dium were detected by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with the normal myocardium, significant larger ratios of the left ventricular wall thickness to the heart weight and the heart weight to the body weight, a significant increase in the cardiomyocyte apoptosis, and a significant larger positive expression index of GRP78/BiP in the hearts 8 weeks after modeling were observed. The protein levels of CHOP/GADD153 and caspase-12 were gradually increased during the development of liver cirrhosis and were significantly increased at 8 weeks. The positive expression of NF-κB p65 and Bcl-2 showed consistent changes, and were markedly higher at 4 weeks than those at the other time points. The positive expression index of GRP78/BiP was positively correlated with the apoptotic index, and the levels of CHOP/GADD153 and caspase-12. The positive expression index of CHOP/GADD153 was negatively correlated with NF-κB p65 and Bcl-2.CONCLUSIONElevated expression of GRP78/BiP may play a crucial role in the pathogenesis of liver cirrhotic cardio-myopathy mediated by endoplasmic reticulum stress.

Glucose-regulated protein 78; Endoplasmic reticulum stress; Liver cirrhotic cardiomyopathy; Apoptosis; Endotoxins

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.05.031

1000- 4718(2013)05- 0941- 06

2012- 06- 28

2013- 03- 19

国家自然科学基金资助项目(No.81070339)；山西省国际科技合作计划资助项目(No.2010081068)；山西医科大学细胞生理学省部共建教育部重点实验室主任基金资助项目(No.2010-09)；山西省回国留学人员科研基金资助项目(No.211-091)

△通讯作者Tel: 0355-3151441; E-mail: zhanghy2001@163.com