hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长*

汤绍辉， 吴胜兰， 王旷靖， 张良鹏， 罗羽宏， 曹明溶， 周鸿科

(暨南大学附属第一医院 1消化科， 2普通外科，广东 广州 510632)

hAFP及hTERT双启动子调控的针对人IGF-II基因的siRNA特异性抑制人肝癌细胞生长*

汤绍辉1， 吴胜兰1， 王旷靖1， 张良鹏1， 罗羽宏2△， 曹明溶2， 周鸿科1

(暨南大学附属第一医院1消化科，2普通外科，广东 广州 510632)

目的设计并筛选高效沉默胰岛素样生长因子II(IGF-II)基因的小干扰RNA(siRNA)序列，构建由重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控的该siRNA表达载体，观察其对肝癌细胞生长的影响。方法根据siRNA设计原则，参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列，转染人肝癌Huh7细胞，转染24 h后采用实时荧光定量PCR检测IGF-II mRNA表达量变化，筛选干扰效率最高的siRNA序列。采用PCR扩增出hAFP及hTERT启动子的核心序列，应用基因重组技术构建重组hAFP和hTERT双启动子调控的该siRNA表达载体。将上述siRNA表达载体转染Huh7细胞及L-02人正常肝细胞，观察IGF-II mRNA表达及细胞生长情况变化。结果实时荧光定量PCR显示，siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高，约90%。成功扩增hAFP及hTERT启动子核心序列，将其分别克隆入pGL3-Basic载体，构建成重组pGL3-hAFP-hTERT载体；将siRNA3克隆至pGL3-hAFP-hTERT载体，构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低，抑制效率达86%，细胞增殖受到明显抑制，G1期细胞比例显著增加；L-02细胞上述指标无明显改变。结论成功构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体，即pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3；该siRNA表达载体可特异性抑制IGF-II mRNA表达及肝癌细胞生长。

hAFP/hTERT双启动子； RNA干扰； 人胰岛素样生长因子II； 癌,肝细胞

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种高效、特异沉默靶基因的新技术。其作用机制是通过双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)经外界导入细胞或细胞内合成后运输到胞浆中，被Dicer酶识别并加工成21～23 nt长度的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，siRNA的反义链使同源mRNA降解，从而抑制靶基因表达[1]。目前制备siRNA的方法主要分为两类：体外合成法与表达载体法。构建siRNA表达载体是通过将siRNA对应的DNA双链克隆到驱动小发夹RNA表达所用的启动子下游而实现的。驱动这些启动子转录的酶有RNA聚合酶II(RNA polymerase II，Pol II)和RNA聚合酶III(Pol III)，这些启动子分别被称为Pol II和Pol III启动子[2]。Pol III启动子可在几乎所有细胞中持续表达，无组织特异性，在肿瘤治疗中可能导致人体正常组织损伤；Pol II启动子，如人甲胎蛋白(human alpha-fetoprotein，hAFP)启动子和人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子，则具有组织特异性[2]，可使靶基因在特定的肿瘤组织中沉默[3]。

人胰岛素样生长因子II(insulin-like growth factor II，IGF-II)是一种由67个氨基酸残基组成的多肽。研究表明，IGF-II的过表达是目前己知的肝细胞癌变过程中发生最早的基因改变事件，对肝癌的发生发展具有重要影响[4-6]。那么，抑制IGF-II的过表达对肝细胞癌是否具有较好的治疗作用？目前国内外尚未见深入的研究报道。鉴于此，本研究拟构建双重RNA聚合酶II启动子(hAFP及hTERT双启动子)调控的针对IGF-II基因的siRNA表达载体，观察其对肝癌细胞生长的影响，为肝癌基因靶向治疗开辟新途径奠定基础。

材 料 和 方 法

1材料

pGL3-Basic 载体(图1)、Lipofectamine® RNAiMAXTM转染试剂和Wizard®基因组DNA 纯化试剂盒均为Promega产品，Trizol试剂为Invitrogen产品，T4 DNA连接酶为TaKaRa产品，DNA凝胶回收试剂盒为广州东盛生物科技有限公司产品，SYBR Green PCR Master Mix为Toyobo产品，人肝癌细胞株Huh7和人正常肝细胞株L-02购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。

Figure 1. Structure of pGL3-Basic vector.

图1pGL3-Basic载体结构图

2方法

2.1针对IGF-II基因的siRNA设计与筛选 根据siRNA设计原则，参照IGF-II mRNA序列(GenBank数据库：NM_000612)设计并合成3对siRNA序列(siRNA1、siRNA2和siRNA3)及1对无任何靶基因的siRNA(NC siRNA)作为阴性对照。培养Huh7细胞至汇合度为30%～50%，采用Lipofectamine® RNAiMAXTM转染试剂进行细胞转染siRNA。实验分为4个组，即空白对照组(NC siRNA)和3个实验组(siRNA1、siRNA2和siRNA3)，每组设置25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L siRNA浓度梯度。转染24 h后，按Trizol试剂盒说明抽提Huh7细胞总RNA，逆转录合成cDNA并进行实时荧光定量PCR扩增。IGF-II mRNA上游引物为5’-CTG GAG ACG TAC TGT GCT A-3’，下游为5’-GAC TGC TTC CAG GTG TCA T-3’，片段长度为128 bp；以18S rRNA为内参照。每个样本同时扩增3复管，并连续进行2次实验。采用相对定量法(2-ΔΔCt) 计算目的基因表达量。

2.2重组hAFP和hTERT双启动子调控的、针对IGF-II基因的siRNA表达载体构建

2.2.1pGL3-hAFP-hTERT载体构建 根据hAFP基因及hTERT基因启动子序列设计引物，从L-02细胞基因组中扩增hAFP及hTERT启动子核心片段(分别为269 bp及456 bp)。hAFP启动子上游引物为5’-cgg ggt acc TGA GGA GAA TAT TTG TTA TAT-3’(含KpnI位点)，下游引物为5’-cta gct agc TGT TAT TGG CAG TGG TGG AAG-3’(含NheI位点)；hTERT启动子上游引物为5’-cta gct agc TGG CCC CTC CCT CGG GTT ACC C-3’(含NheI位点)，下游引物为5’-ccg ctc gag CAT CGC GGG GGT GCC GGG G-3’(含XhoI位点)。

取pGL3-Basic载体及hAFP启动子PCR产物分别行KpnI与NheI双酶切，将hAFP启动子插入pGL3-Basic载体多克隆位点KpnI与NheI之间构建成pGL3-hAFP载体。取pGL3-hAFP载体及hTERT启动子PCR产物分别行NheI与XhoI双酶切，将hTERT启动子插入pGL3-hAFP载体hAFP启动子下游构建成pGL3-hAFP-hTERT载体。上述重组载体送华大基因公司进行测序分析。

2.3重组hAFP和hTERT双启动子调控的siRNA对Huh7细胞IGF-II mRNA表达及细胞生长的影响2.3.1细胞转染及IGF-II mRNA表达分析 采用LipofectamineTM2000转染试剂将pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体及阴性对照载体pGL3-hAFP-hTERT分别转染Huh7细胞及L-02细胞。实验中，每个共转染实验同时做3复孔，并连续进行2次实验。转染48 h后收集细胞，按Trizol试剂盒说明抽提细胞总RNA，检测IGF-II mRNA 表达水平，方法同前。

2.3.2MTS法检测细胞增殖 取上述各组转染细胞，计数，调整细胞浓度为1×108/L，分到96孔板，每孔100 μL。细胞贴壁后，收集各个时点的细胞(0 h、24 h、48 h和72 h)，加入MTS，比例为1/10。孵育4 h后，酶标仪测定A490值。

2.3.3流式细胞仪检测细胞周期 转染48 h后每样离心收集1×106细胞，用PBS洗细胞2次，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜。离心收集细胞，用PBS洗细胞1次，加入含50 mg/L溴化丙啶和100 mg/L RNase A的PBS，4 ℃避光孵育30 min，以标准程序用流式细胞仪检测。

3统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示,组间均数比较采用One-way ANOVA，应用SPSS 13.0统计软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1针对IGF-II基因的siRNA设计与筛选结果

根据IGF-II mRNA序列，设计并合成了3对siRNA，即siRNA1、siRNA2及siRNA3,见表1，分别转染Huh7细胞。转染24 h后，采用实时荧光定量PCR检测Huh7细胞IGF-II mRNA表达量变化。结果显示，转染siRNA1、siRNA2和siRNA3的Huh7细胞中IGF-II mRNA表达量均有不同程度的降低，抑制效率约为65%～90%，其中siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高，达90%,见图2。

表1 siRNA序列

Figure 2. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene on IGF-II mRNA expression in Huh7 cells detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Mean±SD.n=6.

图2各siRNA转染Huh7肝癌细胞24h后对IGF-IImRNA表达的影响

2hAFP和hTERT双启动子调控的、针对IGF-II基因的siRNA表达载体构建结果

图3显示pGL3-hAFP-hTERT重组载体2个阳性克隆的双酶切产物电泳结果。根据上述筛选出的siRNA3，设计表达siRNA3的序列，制备双链siRNA3，克隆入pGL3-hAFP-hTERT载体双启动子下游(XhoI与HindIII位点之间)构建成pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体。测序结果显示，上述各重组载体插入片段序列正确，无突变。

Figure 3. Electrophoresis analysis of pGL3-hAFP-hTERTvectors (A) and their dual enzyme (KpnI andNheI) digestion products (B). M: DNA marker.Arrows indicate the positive target fragments of about 725 bp (hAFP-hTERTdual promoter fragment).

图3pGL3-hAFP-hTERT载体及其双酶(KpnI和NheI)切产物电泳分析

3重组hAFP和hTERT双启动子调控的siRNA可特异性抑制Huh7细胞IGF-IImRNA表达及细胞生长

图4显示，与转染阴性对照载体pGL3-hAFP-hTERT(negative control)及空白对照(blank control)相比，转染pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体(siRNA)的Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著降低，抑制效率达86%(P<0.05)。如此同时，在L-02细胞中，3组IGF-II mRNA表达量无明显变化(P>0.05)。

Figure 4. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on IGF-II mRNA expression in Huh7 cells (A) or L-02 cells (B).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnegative control or blank control.

图4hAFP和hTERT双启动子调控的siRNA对Huh7细胞及L-02细胞IGF-IImRNA表达的影响

图5与图6显示，与转染negative control及blank control相比，转染siRNA的Huh7细胞增殖受到明显抑制，转染后第2天及第3天差异有统计学意义(P<0.05)；细胞周期检测显示G1期细胞比例显著增加(P<0.05)。而3组L-02细胞增殖及G1期细胞比例无明显差异(P>0.05)。

讨 论

人IGF-II基因是一个复杂的转录调控单位，具有9个外显子和4个启动子(P1～P4)[7]。在个体不同组织及不同生长发育阶段，4个启动子呈现动态活性，总共编码5种5′端非翻译区不同的IGF-II mRNA，但其成熟蛋白产物相同。例如，在胎儿和新生儿肝脏中，IGF-II mRNA高水平表达，其转录来源于P2～P4启动子激活，其中P3 活性最大，P1 失活；在出生2个月后，肝脏IGF-II mRNA表达量则显著下调，约为新生儿峰值的1/10，一直至成人期都维持于此低水平状态，其表达主要受控于P1 启动子，P2～P4启动子活性弱或呈关闭状态[8]。

Figure 5. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on the proliferation of Huh7 cells (A) or L-02 cells (B).Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnegative control or blank control.

图5hAFP和hTERT双启动子调控的siRNA对Huh7细胞及L-02细胞增殖的影响

Figure 6. Effects of siRNAs targetingIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters on the cell cycle distribution of Huh7 cells or L-02 cells.Mean±SD.n=6. The percentage of Huh7 cells in G1phase increased significantly in siRNA group compared with negative control or blank control group (P<0.05), and there were no differences of the cell cycle distribution of L-02 cells among the above three groups (P>0.05).

图6hAFP和hTERT双启动子调控的siRNA对Huh7细胞及L-02细胞细胞周期分布的影响

我们课题组和其他学者研究发现，由于P3、P4启动子再激活而导致的IGF-II过表达与肝细胞癌的发生发展密切相关[4-6,9-10]。Dong等[10]报道，肝细胞癌的癌灶、癌旁和远离癌灶的非癌组织中IGF-II mRNA的表达率分别为100%、53.3%和0%，提示IGF-II特异表达于癌变肝细胞及部分不典型增生的癌前肝细胞，正常肝细胞则无表达。将IGF-II反义RNA导入HepG2肝癌细胞后，细胞增殖率下降，凋亡率增加，AFP分泌水平降低，且恶性表型受到显著抑制[11-12]。上述结果提示，IGF-II的过表达对肝细胞癌的发生发展具有重要影响，抑制IGF-II的过表达可能成为肝细胞癌治疗的新靶点。

RNAi是一种经济、快捷、高效抑制特异基因表达的新技术[13]，可能成为恶性肿瘤基因治疗新的选择和希望。siRNA是RNAi过程中的关键中间产物，目前构建siRNA表达载体采用的启动子有Pol II和Pol III启动子，前者包括survivin、hTERT、hAFP启动子等，后者包括H1、U6、tRNA启动子等[2]。Pol III启动子的优点是能够在精确的位置启动与终止转录，表达的siRNA可以在体内实现高效而稳定的基因沉默，但其不足是无组织特异性，在肿瘤基因治疗时可能导致人体正常组织损伤[3]。Pol II启动子的优点是具有组织特异性，可使靶基因在特定的肿瘤组织中沉默，但其不足是转录活性较低[14]。有研究显示，串联2个启动子的核心序列可以增强其转录活性[15-16]。

hAFP是目前特异性最强的肝细胞癌肿瘤标记物，肝细胞癌中hAFP 的阳性率为70%～90%。但是，生殖腺胚胎瘤及少数胃癌、肝炎、肝硬化可较低水平表达hAFP。hTERT是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位，hTERT 在85%～90%的恶性肿瘤及86%肝细胞癌中高表达，而正常细胞则低表达或几乎不表达[17]。因此，将hAFP启动子及hTERT启动子二者串联构建成双启动子来调控siRNA表达，理论上可能只对表达hAFP和(或)hTERT的肝癌细胞靶基因产生特异性沉默作用，而对正常肝细胞几乎不产生影响。

在本研究中，我们根据siRNA设计原则，参照IGF-II mRNA序列设计3对siRNA序列及1对阴性对照序列，分别以25 nmol/L、50 nmol/L和100 nmol/L浓度通过脂质体法转染肝癌细胞Huh7。结果显示，转染siRNA1、siRNA2和siRNA3的Huh7细胞IGF-II mRNA表达量均显示不同程度的下降，其中siRNA3在25 nmol/L浓度时抑制效率最高，为90%。随后，我们成功构建成重组pGL3-hAFP-hTERT-siRNA3表达载体,并将其转染Huh7细胞(表达IGF-II、hAFP 及hTERT)及L-02细胞(表达IGF-II，不表达hAFP 及hTERT)。结果显示，Huh7细胞IGF-II mRNA表达量显著下调，细胞生长受到明显抑制，而L-02细胞IGF-II mRNA表达量及细胞生长无明显改变，提示hAFP/hTERT双启动子调控的siRNA可特异性抑制肝癌细胞IGF-II表达及细胞生长，对正常肝细胞无明显影响，为肝癌的基因靶向治疗提供一种新的选择奠定了基础。本结果与Chen等[16]的研究报道相似，他们发现hAFP/hTERT双启动子有较高的转录活性，并可靶向介导miR-26a在肝癌细胞中表达，特异性抑制其生长。

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HumanIGF-IIsiRNAdrivenbyhAFP/hTERTdualpromotersspecificallysuppressesgrowthofhumanhepatocellularcarcinomacells

TANG Shao-hui1, WU Sheng-lan1, WANG Kuang-jing1, ZHANG Liang-peng1, LUO Yu-hong2, CAO Ming-rong2, ZHOU Hong-ke1

(1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospital,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:yuhongluo123@163.com)

AIM: To design and screen the most effective siRNA targeting human insulin-like growth factor II (IGF-II) gene, to construct an siRNA expression vector driven byhAFP(human alpha-fetoprotein)/hTERT(human telomerase reverse transcriptase) dual promoters, and to observe the effect of the siRNA on the growth of human hepatocellular carcinoma cells.METHODSThree siRNAs targetingIGF-IIgene and one negative control siRNA were designed and synthesized. They were transfected into human hepatocellular carcinoma Huh7 cells. The expression IGF-II mRNA in Huh7 cells was detected by real-time fluorescence quantitative PCR 24 h after transfection to screen the most effective siRNA. The core sequences ofhAFPandhTERTpromoters and the most effective siRNA were cloned into pGL3-basic vector to construct the siRNA expression vector driven byhAFPandhTERTpromoters. The siRNA expression vector was transfected into Huh7 cells and human normal liver L-02 cells, and then the IGF-II mRNA expression in these cells and the cell growth were evaluated.RESULTSThe inhibitory effect of siRNA3 on IGF-II mRNA expression was the strongest at the concentration of 25 nmol/L, with an inhibitory rate of approximately 90%. The core sequence fragments ofhAFPandhTERTpromoters and siRNA3 were successfully cloned into pGL3-basic vector. The expression of IGF-II mRNA in the transfected Huh7 cells was reduced by approximately 86%, and proliferation inhibition and G1-phase arrest of the cells were also observed. However, there were no differences of the above parameters in L-02 cells before and after transfection.CONCLUSIONThe siRNA expression vector targeting humanIGF-IIgene driven byhAFP/hTERTdual promoters was successfully constructed. The siRNA3 expression vector may specifically suppress the expression of IGF-II mRNA and the growth of hepatocellular carcinoma cells.

hTERT/hAFPdual promoters; RNA interference; Insulin-like growth factor II; Carcinoma,hepatocellular

R735

A

1000- 4718(2013)08- 1422- 06

2013- 03- 18

2013- 07- 02

广东省科技计划(No.2012B031800399)；广州市科技计划(No.2011J4100077)；暨南大学第一临床医学院科研培育专项基金资助项目(No.2013107)

△通讯作者Tel: 020-38688039; E-mail: yuhongluo123@163.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.08.014