超声提取茯苓中三萜类成分的工艺研究

张 方，陈 平

(武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉 430023)

茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poria Cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核［1］。茯苓在我国中药史上，具有十分悠久的历史。茯苓的适用范围非常广泛，可单用亦可配伍使用，是多种复方药及中成药的原料，自古就有“十药九茯苓”的美谈。在《神农本草经》中，茯苓亦被视为“上药”，具有渗湿利水，健脾和胃，安魂养神延年之效。常用于治疗小便不利，水肿胀满，痰饮咳逆，心下结痛，脾虚少食，小儿惊厥，老人健忘等症［2］。现代药理学研究，茯苓主要成分有多糖、三萜类化合物及少量脂肪酸和无机物。其中，多糖类如茯苓聚糖等具有明显的抗癌抗肿瘤，增强免疫系统的作用，三萜类化合物及其衍生物有调节免疫的功能，具有良好地抗炎抗衰老的功效。

茯苓中的三萜成分主要为中等极性的同系物，性质相近，提取时多用极性强的有机溶剂甲醇、乙醇长时间冷浸或回流提取［3-8］，亦有用弱极性的乙醚［10］和正己烷［11］回流提取的报道，提取液减压浓缩至干，即得棕黄色含多种三萜成分的混合物。由于其中含有大量的β—茯苓聚糖，因此Tai等［8］通过将其悬于水中，然后用乙酸乙酯再次提取的方法进行纯化。

茯苓三萜成分彼此间的差异小，故其分离多采用层析法，首先将茯苓三萜成分的混合物加到硅胶柱上，用不同比例的甲醇—氯仿(0%—25%)溶剂系统进行梯度洗脱，分段收集洗脱液浓缩至干，再利用该柱或制备TLC、反相HPLC制备柱进行分离，得到的单一成分在甲醇中结晶纯化。如王利亚等应用薄层层析从茯苓的乙醚、乙醇提取物中分离鉴别了8个三萜类化合物Ⅰ—Ⅷ［10］。许先栋等人研究证实其中羊毛甾烷三萜烯型中的茯苓环酮双烯三萜酸是一类新的天然化合物［6］。但有些茯苓三萜成分由于彼此间只差一个双键或为差向异构体，极难分离，为了提高分离效率，可采用制备衍生物的方法，扩大彼此间理化性质的差异达到分离目的。近几年Takaaki Tai等就采用N－氯甲基苯邻二甲酰亚胺处理茯苓三萜成分的混合物得到相应的N－甲基苯邻二甲酰亚胺基酯，然后用TLC法分离确定了3β羟基羊毛甾烷8，24－二烯酸等茯苓三萜成分的结构，并从茯苓皮中分离出3，4位开环的三萜 porieoic acid A和 B;之后从茯苓中分离出三萜 dlhydropachymic acid和茯苓酸:此外还从茯苓皮中分得poricoic acid A，D，DM，AM 和三萜 trametenolicacid，eburicoic acid及其去氢化合物［9］。在茯苓三萜含量测定方面，王少军等人利用改进后简便、快速的茯苓中总三萜类含量的比色法，建立了茯苓三萜类的分析测定体系，以增强对茯苓药材内在质量的控制［12］。本实验采用超声法提取茯苓中三萜类化合物。

1 仪器与材料

1.1 试剂及试药

茯苓(采自湖北省罗田九资河，经专家鉴定为多孔菌科茯苓干燥菌核)，齐墩果酸(中国药品生物制品鉴定所，批号110709)，甲醇、三氯甲烷、甲酸、乙酸乙酯(分析纯，上海强顺化学试剂有限公司)，石油醚、异丙醇、丙酮(分析纯，天津市广成化学试剂有限公司)，水为超纯水(自制)，95%乙醇(实验室自制)，香草醛，浓硫酸，冰醋酸。

1.2 仪器

双频超声波清洗机SB-5200DTS(宁波心芝生物科技股份有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱DHG-9140(上海精宏实验设备有限公司)，电子天平AL204(Mettler-Toledo Group)，旋转蒸发仪RE52-99(上海亚荣生化仪器厂)，循环水式真空泵SHE-D(Ⅲ)(巩义市予华仪器有限责任公司)，薄层硅胶板(青岛海浪硅胶干燥剂厂制造)，UA-5800PC紫外/可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 药材茯苓粉末的制备

先将茯苓药材筛选、洗净，以清除杂质，再置于50℃烘箱中烘干，以降低药材中的水分，干燥后的药材先以小块放入小型粉碎机中，旋紧盖子后，再连上电源，启动定时开关，粉碎药品。然后倒入4号筛子中过筛，将过筛后的茯苓粉末装入储存袋中，放置于阴凉干燥处待用，将未过筛的药材回收。

2.2 齐墩果酸标准曲线的绘制

2.2.1 标准品的配置

齐墩果酸标样:精密称取0.002 0 g齐墩果酸至25 mL的容量瓶中，用95%的乙醇定容至刻度，封盖摇匀(浓度为0.08 mg/mL);新制香草醛溶液:准确称取香草醛2.500 g，置于50 mL锥形瓶中，加入25 mL冰醋酸，使之充分溶解。

2.2.2 检测波长的选择

取不同浓度的齐墩果酸标样溶液，在紫外—可见光区扫描，结果表明:标样溶液均在552 nm处有最大吸收，结果见图1。因此，552 nm作为测定波长，以后的测定均在此最佳波长处测定。

图1 齐墩果酸紫外吸收光谱图

2.2.3 标准曲线的绘制

取6支试管，移取标准溶液体积为0.02 mL，0.05 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.5 mL 于试管中，用吹风机吹干溶剂。各加入香草醛—冰醋酸0.2 mL，浓硫酸0.8 mL，显色。然后迅速置60℃水浴中15 min，取出后冰浴10 min，再加入5 mL冰醋酸震荡均匀。在552 nm波长下测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，以齐墩果酸质量(mg)为横坐标绘制标准曲线，如图2所示。

图2 齐墩果酸标准曲线图

齐墩果酸标准品质量在0—0.04 mg范围内时与吸光度呈良好的线性关系，线性回归方程为Y=17.32X+0.1168，相关系数 R=0.999 8。

2.2.4 显色反应体系的稳定性

按照实验方法，显色后每隔10 min在552 nm处测定体系的吸光度，结果表明:反应体系在100 min内吸光度变化不大。

2.3 茯苓三萜类成分提取的正交试验

用电子天平精密称取9份经过前处理的茯苓粉末1.00 g，放入250 mL的锥形瓶内，按照正交表加入规定量的溶剂，摇匀，浸泡一晚上。然后放入超声仪中提取(超声仪设定温度为25℃，频率为25 kHz)，溶剂种类、溶剂用量、提取时间、次数，按表1的因素水平表进行选取，以齐墩果酸为对照品测得的总三萜得率为考察指标，选用表2所示的L9(34)正交表安排试验，提取液用甲醇补足减失的重量，并用微孔滤膜过滤，收取滤液，编号密封备用。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交实验表

2.3.1 提取液中三萜类化合物的含量测定

样品的制备:为了将试样的浓度在标准曲线的范围内，将试样移取部分(体积V1见表3)，用旋转蒸发仪挥干，固体物质用0.5 mL的甲醇溶解，取出，密封于EP管中。

实验方法:取10支试管，分别标号0—9，其中0号试管为空白对照品。除0号试管以外，其他9号试管分别加入规定体积的浓缩液(体积V2见表3)，用吹风机吹干溶剂。10支试管各加入香草醛—冰醋酸0.2 mL，浓硫酸0.8 mL显色，然后迅速在60℃下水浴15 min，取出后冰浴10 min，再加入5 mL冰醋酸震荡均匀。在552 nm波长下，测定吸光度A。通过标准曲线计算所测的含量m，通过浓缩体积计算总提取含量M。提取总含量计算公式:M=0.5m ×V0/(V2×V1)。

表3 三萜类化合物的含量测定结果

2.3.2 正交数据分析及结论

将实验所得的数据进行直观分析和方差分析，结果如表4和表5所示。

表4 直观分析表

表5 方差分析表

研究表明:确定茯苓酸较优的提取方式，根据预实验及查阅相关资料，筛选出对茯苓酸提取影响较大的几个因素，即溶剂种类A、溶剂用量B、提取次数C、提取时间D。每个因素取三个水平，见表1，结果见表5。直观分析表明A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，D3＞D2＞D1，即 A3B2C3D3的提取率最高的组合。在方差分析表中，因素A和C对茯苓三萜类化合物的提取有显著影响，而因素B和D没有显著影响。其影响大小为A＞C＞D＞B。因提取时间D、溶剂用量B对提取并没有显著影响，所以在考虑成品的情况下，优先选出30 min，20倍溶剂用量作为提取时间和溶剂用量。最优提取方案为A3B1C3D1。

2.4 三萜类化合物的薄层色谱鉴定

2.4.1 薄层色谱展开剂的选择

在参照各类文献基础上，以及对天然产物中三萜类化合物的薄层色谱分离研究，选择以下几种展开剂系统。

①三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸(10∶1∶0.2)。②石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)。③异丙醇∶丙酮(3∶1)。④ 三氯甲烷∶甲醇(5∶1)。

2.4.2 薄层样品的制备

鉴于各提取液中含量不一，为防止因含量太低而显色不清晰，将提取液浓缩至一定体积，再进行点样处理。取一定的体积V0，用旋转蒸发仪挥干溶液，再用0.5 mL甲醇溶解固体物质，即得。薄层样品的制备如表6所示。

表6 薄层样品的制备

2.4.3 浓缩液的薄层展开实验

点样:首先观察硅胶板是否有花斑、水印或是破损处。点样时，先用铅笔在硅胶板上距末端1 cm处轻轻画一条横线，然后用毛细管点样针蘸取适量齐墩果酸标准品和样品液在横线上轻轻点样。采用分量多次点样，每次点样需用吹风机吹干后再二次点样，以免斑点扩散。如果要重新点样，一定要等前一次点样残余的溶剂挥发后再点样，以免点样斑点过大。一般斑点直径大于2 mm，不宜超过5 mm。底线距基线1—2.5 cm，点间距离为1 cm左右，样点与玻璃边缘距离至少1 cm，为防止边缘效应，可将薄层板两边刮去1—2 cm，再进行点样。

展开:展开剂在临用时新配为宜。为达到饱和效果，可在展缸中加入足够量的展开剂，加盖静置0.5 h以上。用镊子将点好样的硅胶板放入展缸中，注意原点不能浸入展开剂中，待展开剂达到前沿(1—2 cm)时，取出硅胶板，晾干。

显色:本法采用化学试剂显色，配置10%浓硫酸乙醇溶液于浸渍槽中，将硅胶板插入浸渍槽中，充分浸渍，取出，在120℃下显色。

2.4.4 显色分析

硅胶板显色后，观察分离效果和显色效果，并及时用相机拍照。结果如图3所示。

图3 标准品和样品在4种展开剂下的薄层色谱图

如图3所示，0号为齐墩果酸对照品，1—9号分别为样1到样9。观察薄层板上的分离状况和是否有拖尾现象。2号和4号有严重的拖尾现象。3号展开剂虽然没有拖尾，但是对茯苓中三萜类化合物的分离效果不好。1号展开剂不仅分离出有效成分，而且显色清晰，无明显拖尾现象。最终确定1号展开剂系统:三氯甲烷、乙酸乙酯，甲酸三者比例为10∶1∶0.2，为本实验的最优展开剂系统。再次试验，结论相同。

2.4.5 薄层色谱的图谱分析与结论

采用不同提取方法所得提取物与齐墩果酸对照品均出现相同颜色的斑点(在白色底板上，呈淡紫色)，说明其中均含有三萜类化合物，定性确定了提取液中三萜类化合物的存在。茯苓提取物薄层色谱分离实验中的Rf值，均在0.2—0.8范围内。一般来讲，在吸附薄层上物质的Rf值与物质的极性有关，极性小的物质往往走在前面，Rf值较高;反之极性大的物质Rf值较低。从图中斑点及Rf值可以看出，茯苓在提取物所含成分中Rf值较小，极性较大。本实验为茯苓三萜类化合物的分析制备、含量测定及指纹图谱的研究提供了选择流动相的依据。

3 结束语

在本次实验中，通过大量阅读参考文献后，确定了实验的基本思路与方案。选取超声波提取作为提取茯苓中三萜类化合物的方法，用薄层色谱法作为鉴别方法，紫外/分光光度法作为含量测定。用正交试验法考察溶剂种类、溶剂用量、提取次数、提取时间对茯苓中三萜类化合物得率的影响，得出:溶剂种类影响最大，其次是提取次数，最后是溶剂用量。优选出最佳提取工艺为20倍量的乙酸乙酯提取三次，每次30 min。本文论点明确，论据充分切题，实验方案及技术路线正确，达到了预期的目标。为了提取茯苓三萜类化合物，运用分光光度法测定茯苓药材中三萜类的总量的分析方法，利用香草醛—浓硫酸与三萜类化合物反应生成有色化合物的原理，以齐墩果酸为对照品，对茯苓中三萜类的物质进行测定，再根据标准曲线计算茯苓三萜化合物的含量，建立了一种简便测定方法，为茯苓三萜类化合物的分析制备、含量测定及指纹图谱的研究提供了选择流动相的依据。为茯苓的进一步开发提供了一定的参考价值。

［1］国家药典委员会.中国药典I部［M］.北京:化学工业出版社，2010:224.

［2］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编(上册)［M］.北京:人民卫生出版社，1976:372.

［3］Takaaki Tai，Akira Akahori，Tecsuro Shingu.Triterpenoids from Poria COCOS［J］.Phyto-chemistry，1991，30(8):2796-2797.

［4］Takaaki Tai，AkiraAkahori，Tecsuro Shingu.A lanoscane triterpenoid from Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1992，31(7):2548-2549.

［5］Takaaki Tai，Akira Akahori，Tecsuro Shingu.Triterpenes of Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1993，32(5):1239-1244.

［6］许先栋，许津，顾惠儿，等.茯苓环酮双烯三萜酸的晶体结构和分子结构研究［J］.中国药物化学杂志，1994，114(1):23.

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［9］Takaaki Tai，Tetsuro Shingu，Tohru Kikuchi，et al.Triterpenes from the surface of Poria COCOS［J］.Phytochemistry，1995，39(5):1165-1169.

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