高效液相色谱-串联质谱法测定饲料和卧床土中的环境雌激素

李 雪，牟光庆，陈历俊＊，姜铁民

（1.大连工业大学食品学院，辽宁 大连 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100076）

环境雌激素是指由于人类的生产、生活而释放到环境中，进入生物体内后起到类似雌激素的作用，从而扰乱生物体正常内分泌功能的一类人工合成化学物 质［1，2］。另外，一些天然雌激素（如雌三醇（E3）、雌二醇（E2）、雌酮（E1）等）也能产生上述环境雌激素污染［3］。由于环境雌激素具有毒性作用剂量少、潜伏期长、易富集的特点，必须提高对环境雌激素污染问题的认识和研究。

在各种食品污染问题中，雌激素残留问题最容易被忽视，而在近几年，奶制品中雌激素残留的问题日益严重，因此必须从奶源根部抓起，追溯到奶牛养殖场的微环境，从根源发现和解决问题，完成环境雌激素的检测。在人们的关注中，除了要监控奶制品加工过程中的雌激素添加外，还应把眼光投放在牛场微环境中残存的环境雌激素，因为牛奶中的环境雌激素主要是外源性性激素，通过饲养奶牛所用的饮用水、卧床土、动物饲料及催熟植物所用的生长调节剂等而引入［4］。

目前国内外关于环境雌激素多残留检测的方法主要有气相色谱-质谱法和液相色谱-质谱法［5-16］。这些方法测定的样品以奶制品［5-8］和水样［9-11］为主，另 外 还 有 水产 品［12］、化 妆 品［13］、肉 制 品［14］、污泥［15，16］、尿液［17］等。而关于饲料和卧床土中环境雌激素的研究报道很少，特别是本文研究的雌三醇、雌二醇、雌酮、双酚A（BPA）和己烯雌酚（DES）这5种环境雌激素同时检测的分析方法更是少之又少。本实验通过对取自于北京地区不同奶牛养殖场的饲料和卧床土样品环境雌激素多残留测定，建立了饲料和卧床土中环境雌激素多残留测定的液相色谱-串联质谱法，并对色谱条件、质谱条件及样品前处理方法等进行了优化，取得了较为满意的结果；完成了对奶牛养殖场微环境中的饲料和卧床土的环境雌激素的追踪与检测，为追溯原料奶中环境雌激素的来源提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；API4000串联四极杆质谱仪（美国Waters公司），配有MassLynx数据处理系统；KQ-500DE医用数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sigma 2K-15高速冷冻离心机（北京博劢行仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海振捷实验设备有限公司）；SHB-Ⅲ型水循环真空泵（郑州市上街区仪器厂）。

5种环境雌激素标准品:雌三醇、雌二醇（中国食品药品检定研究所），雌酮、双酚 A（德国Dr.Ehrenstorfer公司），己烯雌酚（中国计量科学研究院），纯度≥96.70%。NH2固相萃取柱（500mg／3 mL，美国Agela公司）。甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）。氨水、甲苯、无水硫酸钠（分析纯）。超纯水（美国Milli-Q超纯水仪制备）。氮气、氩气（纯度＞99.99%）。微孔滤膜（孔径0.22μm）。饲料、卧床土（北京市11个奶牛养殖场）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的制备

准确称取E3、E2、E1、BPA以及DES标准品10.00mg，分别置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，超声振荡均匀后得到E3、E2、E1、BPA及DES（质量浓度均为1.00g／L）的单一标准品储备液，于-20℃冰箱内保存备用。其他不同浓度的各标准溶液由储备液稀释得到。

1.2.2 样品的提取与净化

将饲料用搅碎机绞碎、研磨，过20目筛，混匀，低温避光保存。将卧床土样品自然风干（避免阳光直射）后，研磨成粉末，过20目筛，混匀，避光保存。

称取饲料样品2.00g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入10mL乙腈，漩涡混匀1min，于25℃下超声25min，在4℃下以12000r／min离心10 min，上清液收集于15mL离心管内，待下一步的净化处理。

先在NH2固相萃取小柱中加入约2cm高无水硫酸钠（经650℃烘烤4h，保存在干燥器内，冷却后备用），下接旋转瓶放在固定架上。用4mL乙腈-甲苯（3∶1，v／v）淋洗 NH2柱，使其处于活化状态。将上清液过柱富集，控制流速在1.00～1.50mL／min范围，然后用25mL乙腈-甲苯（3∶1，v／v）洗涤小柱，收集所有流出液于旋转瓶中并在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。用5mL乙腈分3次（2mL＋2 mL＋1mL）洗涤旋转瓶，将洗涤液收集于10mL具塞离心管中，并在40℃条件下用氮气缓慢吹干。用1mL乙腈-甲醇（4∶1，v／v）-0.01%氨水（2∶3，v／v）溶液溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤，移入1.5mL自动进样器样品瓶中，供HPLC-MS／MS测定。

卧床土样品的前处理方法同上。

1.2.3 HPLC-MS／MS分析条件

HPLC条件 色谱柱:Acquity UPLCTMHSS T3色谱柱（50mm×2.1mm，1.8μm）；流动相:乙腈-甲醇（4∶1，v／v）（A）与0.01%氨水（B）。梯度洗脱程序:0～3min，40%A～50%A；3～5min，50%A～80%A，保持 0.5min；5.5～5.6min，80%A～40%A，保持3min；流速:0.3mL／min。柱温:35℃；样品温度:25℃；进样量:10μL。

MS／MS条件 离子源:电喷雾离子源（ESI）；扫描方式:负离子扫描；检测方式:多反应监测（MRM）；毛细管电压:2.37kV；离子源温度:120℃；脱溶剂气温度:450℃；脱溶剂气（N2）流量:800 L／h；锥孔气（N2）流量:50L／h；碰撞气体:氩气；碰撞气流速:0.14mL／min。定性离子对、定量离子对、去簇电压（DP）及碰撞能量（CE）见表1。

表1 5种环境雌激素的质谱参数Table 1 MS／MS parameters for the determination of the five environmental estrogens

图1 提取溶剂对饲料样品中5种环境雌激素回收率的影响Fig.1 Influence of extraction solvents on the recoveries of the five environmental estrogens in cow feed

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 提取溶剂的选择与优化

本文检测的5种环境雌激素都属于疏水性有机化合物，易溶于大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对饲料样品进行提取，先后比较了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4种溶剂的提取效果，得到5种环境雌激素的回收率（见图1）。结果发现，乙腈能有效沉淀样品中的蛋白质，其总提取效率最高，且提取液清澈，本底干扰少；由于饲料本身成分复杂，含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯为提取剂时混浊现象严重，即使在12000 r／min条件下离心10min也不能很好地消除这种现象，从而造成提取液中含有大量的杂质，给后续的净化工作带来了很大的困难，而且乙酸乙酯提取E3的回收率低于20%；除了对E3外，甲醇的提取效果没有乙腈好，且甲醇很难与水相分层，提取液中残存少量杂质，不利于净化过程，易造成固相萃取小柱堵塞。实验也考察了在提取过程中加入三氯乙酸和0.10%乙酸溶液对饲料中复杂基质的沉淀效果，以期能得到更纯净的提取液，结果表明，加入0.10%乙酸溶液的样品过固相萃取柱时会使小柱堵塞；而加入三氯乙酸溶液的样品提取率反而降低。又采用同样的办法对卧床土样品进行提取，结果发现，4种溶剂的提取效果与饲料样品的结果一致。因此，选择乙腈作为本实验的提取溶剂。通过考察不同提取温度（20、25、30 ℃）和超声时间（20、25、30min）对提取效率的影响发现，在25℃下超声25min时提取效率最高，故本实验选择在此条件下进行提取。

2.1.2 固相萃取柱的选择

饲料和卧床土的组成成分复杂，为避免污染色谱柱，减少干扰峰的存在，对样品前处理有严格的要求。一般来讲，样品前处理过程复杂，有的需要有衍生化步骤或者用两种固相萃取柱连续过柱。本实验采用乙腈溶解样品，超声离心后，上清液通过活化好的NH2柱，再经水浴旋转蒸发和氮气吹干两步浓缩，将环境雌激素全部富集，用初始比例的流动相溶液溶解，然后过滤检测分析。经对比实验发现，NH2柱比PEP柱和C18柱的净化效果好，更适合用于饲料和卧床土中环境雌激素的富集，得到的目标组分回收率均较高（见图2和图3），而且大大缩短了前处理时间。

图2 不同固相萃取柱对饲料样品中环境雌激素回收率的影响Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of the five environmental estrogens in cow feed

2.2 流动相的选择

图3 不同固相萃取柱对卧床土样品中环境雌激素回收率的影响Fig.3 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of the five environmental estrogens in soil

分别选择甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01%氨水、乙腈-0.01%氨水4种体系为流动相，结果显示，以氨水作为水相比水的效果好，这是由于所检测的5种环境雌激素均为极性物质，在以氨水为流动相的碱性环境中，能将5种物质的分子变为更全面的离子碎片，从而提高响应信号，使分离效果更为明显。其中，以甲醇-0.01%氨水为流动相时，5种环境雌激素的响应值虽然很高，但是峰形存在拖尾现象，而且双酚A与雌二醇的出峰时间几乎重合，不能完全分离，影响物质的定量；而以乙腈-0.01%氨水为流动相时能将5种物质全部分离，并得到很好的峰形，但是各物质的响应值偏低。故将乙腈和甲醇以不同比例混合，再与0.01%氨水混合作流动相，观察5种物质的分离效果和响应值。结果显示，乙腈-甲醇的配比为4∶1（v／v）时响应值最高，且分离效果最好。由于这5种环境雌激素的结构不同，所以极性存在细微差异，在等度条件下洗脱使5种物质同时达到完全分离需要较长时间的稳定和平衡，且保留时间的重现性较差，故本文采用梯度洗脱方式进行分离。图4为在1.2.3节色谱条件下得到的混合标准溶液色谱图。

2.3 质谱条件的优化

图4 5种环境雌激素混合标准溶液（0.2 mg／L）的色谱图Fig.4 Chromatogram of a mixed standard solution（0.2 mg／L）of the five environmental estrogens

图5 （a）雌三醇、（b）雌二醇、（c）雌酮、（d）双酚 A和（e）己烯雌酚的质谱图Fig.5 MS spectra of（a）estriol，（b）estradiol，（c）estrone，（d）bisphenol A and（e）diethylstilbestrol

将5种环境雌激素的单标准溶液在m／z 50～500范围内分别在正、负离子模式下进行离子扫描，结果发现，这5种物质只有在负离子模式下才有响应信号，故而采用1mg／L的各环境雌激素标准溶液进行流动注射分析，以负离子模式在m／z 50～320扫描范围内优化质谱参数。确定5种物质的主要离子碎片为:雌三醇m／z287、145、171、143、183；雌二醇m／z271、145、183、143、158；雌酮m／z 269、145、159、183、143；双酚 A m／z 227、212、133、93、211；己烯雌酚m／z 267、237、251、222、93（见图5）。其中，雌三醇的碎片离子m／z 287为其分子离子去掉一个质子后形成的准分子离子峰［M-H］-，m／z 171为准分子离子失去C6H6-CH2CH2CH3后的产物，其丰度最大，结构稳定；雌二醇的碎片离子m／z 271为其分子离子去掉一个质子后形成的准分子离子峰［M-H］-，m／z 183.1为准分子离子失去CH3（CH2）3CH2O的产物，该产物继续失去2个H2O和2个质子后形成丰度最大、结构稳定的碎片离子m／z145；雌酮的碎片离子m／z 269为其分子离子去掉一个质子后形成的准分子离子峰［MH］-，m／z159为分子离子失去CH3（CH2）5CH2O的产物，m／z145则为多失去一个CH2后形成的丰度最大的离子峰；双酚A的碎片离子m／z227为其分子离子去掉一个质子后形成的准分子离子峰［M-H］-，m／z212为准分子离子峰失去CH3后的离子峰，其丰度最大；己烯雌酚的碎片离子m／z267为其分子离子失去一个质子后形成的准分子离子峰［M-H］-，m／z251为准分子离子去掉CH3和一个质子后达到最大丰度的离子峰。选择丰度大的m／z145和m／z 171作为雌三醇的监测离子，m／z 183.1和m／z145作为雌二醇的监测离子，m／z159和m／z145作为雌酮的监测离子，m／z 133和m／z 212.1作为双酚 A的监测离子，m／z 237.1和m／z 251.2作为己烯雌酚的监测离子；选择其中信噪比较高的离子作为定量离子，故分别以第二个离子作为每种物质的定量离子。按表1选择1个母离子和2个子离子可满足环境雌激素的定性要求。当两对离子对均出现，且离子对丰度比与标准溶液中的离子对丰度比一致时，则认为该组分被检出。

2.4 标准曲线和检出限

分别量取E3、E2、E1、BPA和DES的单一标准储备液（质量浓度为1.00g／L）各1.00mL，用甲醇定容于100.00mL容量瓶中，得到质量浓度为10.00mg／L的混合标准溶液。分别取适量的混合标准溶液，用乙腈-水（1∶1，v／v）稀释，配成质量浓度依次为5、10、20、50、100、200μg／L的混合标准溶液，在优化后的色谱、质谱条件下，按照质量浓度从低到高的顺序依次进样，得到不同质量浓度时的峰面积，以质量浓度X（μg／L）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准工作曲线。结果显示，5种环境雌激素在5.00～200.00μg／L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.998（见表2）。通过空白样品添加试验，以S／N＝3和S／N≥10分别求得5种环境雌激素的方法检出限（LOD）和方法定量限（LOQ）（见表2）。

表2 5种环境雌激素的线性方程、检出限和定量限Table 2 Linear equations，limits of detection（LOD，S／N＝3）and limits of quantification（LOQ，S／N≥10）of the five environmental estrogens

2.5 加标回收率和精密度

在饲料和卧床土样品中均分别添加1.00、2.00、10.00μg／kg 3个水平的混合标准溶液，按照样品前处理方法进行提取和净化，在优化的HPLCMS／MS条件下测定，每个添加水平重复6次测定，得到样品中5种环境雌激素的平均回收率和精密度，检测结果见表3。

2.6 样品测定

在上述色谱条件下对来自11个养牛场的11份饲料和11份卧床土样品分别进行检测，结果从部分样品中不同程度地检出这5种环境雌激素，其中3份饲料和7份卧床土中检出雌三醇（含量为2.39～18.95μg／kg），1份饲料和5份卧床土中检出雌二醇（含量为1.27～4.49μg／kg），2份饲料和11份卧床土中检出雌酮（含量为1.62～73.97μg／kg），2份饲料和9份卧床土中检出双酚A（含量为4.97～30.12μg／kg），3份卧床土中检出己烯雌酚（含量为1.00～16.04μg／kg），饲料中未检出己烯雌酚。图6和图7分别为其中1份饲料和1份卧床土阳性样品的色谱图。

表3 5种环境雌激素在饲料和卧床土样品中3个添加水平下的平均回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and RSDs of the five environmental estrogens spiked in cow feed and soil samples at three different levels（n＝6）

图6 饲料阳性样品的色谱图Fig.6 Chromatogram of a positive cow feed sample

图7 卧床土阳性样品的色谱图Fig.7 Chromatogram of a positive soil sample

本文所测定的饲料样品主要分为两类，一类是泌乳牛浓缩饲料，另一类为配合饲料，其中还混合玉米青贮、麦秆等农作物。由于种植农作物的微环境在过去十几年里受到人为污染和破坏，导致混合饲料中环境雌激素微量残留的存在有待进一步的调查和跟踪。本文所测定的卧床土样品也主要分为两大类，一种为细沙型卧床土，另一种为奶牛粪便改良农用卧床土，并以后者居多。以土壤作为原材料的卧床土中只含有痕量的雌酮和双酚A，而以牛粪作为原材料的卧床土中含有含量很高的环境雌激素，主要还是以奶牛内源性雌激素雌三醇、雌二醇和雌酮为主。

3 结论

本实验建立了饲料和卧床土中雌三醇、雌二醇、雌酮、双酚A和己烯雌酚这5种环境雌激素残留量的HPLC-MS／MS测定法。以追溯鲜奶中存在的环境雌激素来源为目的，检测来自不同养殖场的饲料和卧床土，根据上述实验结果可知，尽管现在养牛场取样操作严谨，每次都对奶牛进行清洗和消毒，但仍不能完全避免人为操作错误，故部分养牛场可通过用细沙型卧床土取代奶牛粪便改良农用卧床土的方法，排除可能污染鲜乳的环节。该方法具有简单快速、灵敏度高和准确性高的特点，适合于饲料和卧床土样品中多种环境雌激素的同时测定，并为鲜乳中环境雌激素的来源分析与追溯提供了一定的参考依据。

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