固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法同时检测尿样中的麻黄碱和N-甲基麻黄碱

张 琳，张福成，王朝虹，蒋 晔＊，许 萌，李 虹

（1.河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017；2.空军总医院，北京 100142；

3.最高人民检察院司法鉴定中心，北京 100040；4.云南省公安厅刑警总队，云南 昆明 650000）

麻黄碱和N-甲基麻黄碱具有扩张支气管、抗过 敏和镇咳作用，是感冒药中的常见成分。其中，麻黄碱具有较强的兴奋作用［1］，是国际奥委会严格禁止的兴奋剂。因此，体育赛事前确定运动员是否摄取该类药物时，常需进行尿样等生物检材的检测。对于具有器质性心脏病的人员，服用含麻黄碱的制剂还可引起意外心律紊乱而致死。此外，二者还是制造苯丙胺类毒品的主要原料，从吸毒人员体内采集的血样、尿样及毛发等生物检材中检测该类物质是刑侦机构立案的重要依据。因此，建立快速、灵敏的生物样品中痕量麻黄碱分析方法，可大大延长生物检材的检测周期，用于追溯特殊人群的用药史，对于药物的安全使用具有重要意义。

生物检材成分复杂而待测物含量往往较低，因此常需对生物样品中的待测物进行提取、纯化和富集，以提高检测灵敏度。已报道的生物样品前处理方法有稀释法［2］、蛋白沉淀法［3］、液相萃取法［4-11］、中空纤维液相微萃取法［12］、衍生化法［13-15］、超滤法［16］等。但这些方法均存在一些缺点:稀释法严重污染色谱系统；蛋白沉淀法会导致样品稀释，检测灵敏度降低；液相萃取操作繁琐；衍生化法往往受到衍生化效率的限制；中空纤维微液相萃取法的重现性较差；而超滤法存在浓差极化现象，导致测定结果失真。此外，文献［17-19］报道了用固相萃取-液相色谱-质联用的方法检测生物样品中的麻黄碱，检测灵敏度为0.1～1μg／L，对未及时取样且浓度极低的样品往往无法获得满意的分析结果。因此，本文建立了固相萃取-超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法（SPE-UPLC-ESI MS／MS）联用技术同时定量测定尿样中的痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱。该方法能有效提取、纯化和富集待测物，灵敏度高，结果准确。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高相液相色谱仪，Xevo TQ-MS串联四极杆质谱仪和MasslynxTM工作站（美国Waters公司）。Milli-Q超纯水制造系统（美国Millipore公司）；固相萃取仪（美国 Waters公司），Oasis HLB和Oasis MCX固相萃取柱（1mL，30mg；美国 Waters公司）。

盐酸麻黄碱（批号:171241- 200404）和盐酸甲基麻黄碱（批号:171247- 200301）对照品购于中国药品生物制品检定所，纯度均大于99.5%；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 尿样前处理

尿样采自健康受试志愿者。精密吸取4mL尿液置于离心管中，加入200μL 5mol／L盐酸溶液酸化，在离心力8000g条件下离心5min。取上清液过MCX固相萃取柱（预先分别用1mL甲醇和1 mL水活化、平衡），依次用1mL 0.1mol／L盐酸溶液、1mL甲醇和1mL 5%（体积百分数，下同）氨水溶液淋洗，用1mL甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液洗脱，接收洗脱液，待UPLC-ESI MS／MS分析。

1.3 色谱与质谱条件

ACQUITY UPLC BEH Phenyl色谱柱（10cm×2.1mm，1.7μm）；流动相 A为乙腈，流动相B为0.3%甲酸溶液。洗脱梯度:0～3min，流动相A比例由10%升至55%，4min时升至90%，4.1min降至10%，保持1.9min。流速:0.4mL／min；柱温:35℃；样品室温度:10℃；进样体积:2μL。

电喷雾离子源正离子扫描，多反应监测模式；毛细管电压:3.0kV；离子源温度:300℃；去溶剂温度:500℃，去溶剂气流量:1000L／h；锥孔气流量:30L／h；碰撞气流量:0.15mL／min。待测物的监测离子及驻留时间、锥孔电压、碰撞电压等参数见表1。

表1 麻黄碱和N-甲基麻黄碱的质谱参数Table 1 MS／MS parameters of ephedrine and N-methylephedrine

2 结果与讨论

2.1 系统适用性试验

在1.3节的条件下，混合对照品溶液、空白尿样和口服急支糖浆制剂7d后的尿样分别经Oasis MCX固相萃取后的UPLC-MS／MS谱图见图1。空白尿样中不含待测物，且空白基质对待测物的测定无干扰。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱的选择

近年来，采用离子对色谱法分析检测生物碱的报道较多［17］，但这给质谱检测带来困难。本文在酸性流动相（流动相B为0.1%甲酸溶液）条件下，分别考察了 HSS SB（5cm）、BEH C18（10cm）、CSH C18（5cm）、BEH Phenyl（10cm）4种色谱柱（柱内径均为2.1mm，填料粒径均为1.7μm）对待测物灵敏度和分离度的影响（见图2）。结果表明，以BEH Phenyl色谱柱为分离柱时，待测物的灵敏度较高，且分离度较好。

图1 （a）混合对照品溶液（1μg／L）、（b）空白尿样和（c）口服急支糖浆制剂7 d后的尿样分别经MCX柱固相萃取后的UPLC-MS／MS定性和定量离子流谱图Fig.1 UPLC-MS／MS qualitative and quantitative ion current chromatograms of（a）mixed standard solution（1μg／L），（b）human blank urine，and（c）urine after 7 d administering Jizhi Syrup extracted by MCX solid phase extraction＊quantitative ion.

图2 不同色谱柱对待测物灵敏度的影响Fig.2 Effect of different chromatographic columns on the sensitivity of the analytes

2.2.2 流动相的选择

以BEH Phenyl色谱柱作为分离柱，分别考察了酸性流动相（流动相B为0.1%甲酸溶液）和碱性流动相（流动相B为10mmol／L碳酸氢铵溶液，pH 10）对待测物灵敏度及峰形的影响（见图3）。结果表明，待测物在酸性流动相下的灵敏度略高于碱性流动相，最终选择酸性流动相。

图3 不同流动相对待测物灵敏度的影响Fig.3 Effect of different mobile phases on the sensitivity of analytes

图4 不同甲酸浓度对待测物灵敏度的影响Fig.4 Effect of different volume percentages of formic acid on the sensitivity of analytes

2.2.3 甲酸浓度的选择

酸性流动相中甲酸的浓度不同，对待测物灵敏度及峰形有不同程度的影响，因此以BEH Phenyl色谱柱作为分离柱，分别考察了0.1%甲酸溶液和0.3%甲酸溶液作为流动相对待测物灵敏度的影响（见图4）。结果表明，以0.3%甲酸水溶液作为流动相时，待测物的灵敏度较高，且峰形较好，最终选择在酸性流动相中添加0.3%的甲酸。

2.3 样品前处理条件的选择

2.3.1 固相萃取柱的选择

由于待测组分呈碱性，在反相色谱填料上的保留很弱，因此很难利用一般的固相萃取小柱达到萃取的目的。本文考察了含有吸附性填料的Oasis HLB固相萃取柱和兼具离子交换和反相保留的Oasis MCX固相萃取柱对样品的提取净化效果。在不含待测物的空白尿中分别添加0.0250、0.250和2.50μg／L的混合标准溶液，按1.2节的方法处理样品，在1.3节的条件下进行测定，比较样品的基质效应（见表2）。

结果表明，HLB柱作为萃取柱会产生严重的离子抑制效应，影响检测灵敏度和准确度，故选择MCX柱作为固相萃取柱。

2.3.2 洗脱条件的选择

表2 Oasis HLB与Oasis MCX固相萃取柱萃取效果的比较（n＝6）Table 2 Comparison of the extraction efficiencies of Oasis HLB and Oasis MCX SPE columns（n＝6）

为了使待测物在固相萃取柱上得到最好的保留，上样前需要对样品进行酸化以保证待测组分的完全离子化。试验表明，4mL尿液中加入200μL 5 mol／L的盐酸溶液可保证待测组分完全吸附在填料上。尿液等生物样品基质非常复杂，采用质谱检测时基质效应对检测结果的准确性影响很大。为了尽可能地去除基质，本实验采用酸洗、醇洗和碱洗三步清洗，选择性除去非极性的中性物质、酸性以及极性碱性干扰物，最后采用碱性的甲醇溶液进行洗脱。考察了不同比例的甲醇-氨水溶液的洗脱能力。结果表明，以甲醇-氨水（95∶5，v／v）溶液作为洗脱液时，待测物的回收率最高，故选择其作为洗脱液。

2.4 线性范围和检出限

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱质量浓度为1、2、5、10、20、50、100μg／L的混合对照品溶液和内标氘代苯丙胺质量浓度为10μg／L的对照品溶液。吸取上述系列浓度对照品溶液各250μL至7个离心管中，分别加入250μL内标溶液，最后用空白尿稀释至10mL，配制成质量浓度分别为0.0250、0.0500、0.125、0.250、0.500、1.25、2.50μg／L 的样品溶液。按1.2节的方法处理样品，按1.3节的条件进样测定，记录峰面积。以待测物与内标峰面积比（Y）对质量浓度（C，μg／L）进行线性回归，得到麻黄碱和N-甲基麻黄碱在0.0250～2.50μg／L质量浓度范围内的线性方程分别为Y＝8.12C-0.143（r＝0.9998）和 Y ＝4.09C＋0.735（r＝0.9992）。取线性最低点溶液逐倍稀释，按1.3节的条件进样测定，得麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检出限 均 为 0.01 μg／L （S／N ＝ 3），均高于文献［5-7，12，14-17，19］报道。

2.5 精密度、准确度、基质效应及提取回收率

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱低、中、高3个浓度分别为0.0250、0.250和2.50μg／L的质控（QC）样品，每个浓度6份，按1.2节的方法处理样品，在1.3节的条件下进行测定，记录峰面积As，计算日内精密度和准确度；连续测定3d，计算日间精密度。同时，取空白尿，按1.2节的方法处理后，配制成低、中、高3个浓度的溶液，每个浓度6份，在1.3节的条件下进行测定，记录峰面积Am；另取上述3个浓度的对照品溶液，不经萃取直接进样，记录峰面积为Astd。以As／Am计算提取回收率，Am／Astd计算基质效应，结果见表3。

表3 麻黄碱和N-甲基麻黄碱的精密度、准确度、基质效应及提取回收率（n＝6）Table 3 Precisions，accuracies，matrix effects and recoveries of ephedrine and N-methylephdrine（n＝6）

2.6 样品稳定性

配制麻黄碱和N-甲基麻黄碱低、中、高3个质量浓度分别为0.0250、0.250和2.50μg／L的质控样品，每个浓度3份。将上述样品于室温放置24h及经过3次冻融循环后，按1.2节方法处理，并在1.3节的条件下进行测定，考察其短期稳定性及冻融稳定性（见表4）。结果表明，麻黄碱和N-甲基麻黄碱在上述条件下均稳定。

表4 麻黄碱和N-甲基麻黄碱的稳定性（n＝3）Table 4 Stabilities of ephedrine and N-methylephedrine（n＝3）

2.7 真实样品测定

采集健康志愿者口服10mL急支糖浆制剂7d后的尿样，按1.2节方法处理样品，并按1.3节的条件进行测定，尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的质量浓度分别为0.034和0.137μg／L。表明该方法能够有效测定尿样中痕量的麻黄碱和N-甲基麻黄碱，大大提高检测灵敏度，并延长了尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测周期。

3 结论

本实验采用Oasis MCX固相萃取柱对尿样进行提取、纯化和富集，建立了SPE-UPLC-ESI MS／MS方法分析尿样中痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱，显著提高了检测灵敏度，大大延长了尿样中麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测周期，为未及时取样且浓度极低的样品中痕量麻黄碱和N-甲基麻黄碱的检测提供了有效的方法。

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