超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中毒死蜱的主要代谢产物3，5，6-三氯-2-吡啶醇★

王 娜，孙 娟，，石利利＊，吉贵祥，陈国松

（1.环境保护部南京环境科学研究所，江苏 南京 210042；2.南京工业大学理学院，江苏 南京 210044）

毒死蜱（chlorpyrifos）是我国生产和使用量都非常可观的一种广谱有机磷杀虫剂［1］。毒死蜱被人体吸收后，主要分布在肝脏、肾脏、脾脏等血流量较高的器官，经脂酶分解成一系列代谢产物，包括二乙基-硫代磷酸酯（diethyl thiophosphate，DETP）、二乙基-磷酸酯（diethyl phosphate，DEP）和3，5，6-三氯-2-吡啶醇（3，5，6-trichloro-2-pyridinol，3，5，6-TCP）［2］，结构如图1所示。研究［3］表 明，3，5，6-TCP是毒死蜱在人体中经肾脏排泄的最主要的代谢产物。因此，人尿液中3，5，6-TCP的浓度是人体毒死蜱生物负荷的一个特异性生物监测指标，可反映毒死蜱这种外源性污染物质对人体产生的危害，如抑制人体红细胞乙酰胆碱酯酶活性以及导致血色素浓度下降等［4］。

图1 （a）毒死蜱、（b）3，5，6-TCP、（c）DETP和（d）DEP的结构式Fig.1 Chemical structures of（a）chlorpyrifos，（b）3，5，6-TCP，（c）DETP and（d）DEP

目前，3，5，6-TCP的测定大都是以血浆或尿液为基质。仪器分析方法包括气相色谱（GC）法［5］、气相色谱-质谱（GC-MS）法［3，6］、高效液相色谱（HPLC-UV）法［7，8］、液相色谱-质谱（LC-MS）法［9］等。运用GC法时，前处理时需要对3，5，6-TCP进行衍生化，合成易于气化的产物。衍生化过程不仅繁琐而且具有重现性差的缺点。运用HPLC-UV法时，紫外检测器的非特异性制约了整个分析方法的灵敏度，同时对生物样品的净化提出了非常严格的要求，否则极易出现假阳性。有文献［2］报道运用LC-MS／MS法测定尿液中3，5，6-TCP，定量限高达0.25mg／L，所以只能用于毒死蜱急性中毒的鉴定，无法用于毒死蜱的人体健康风险暴露评估以及其生物负荷的痕量监测。因此，建立毒死蜱的主要代谢产物3，5，6-TCP在人尿中的痕量分析技术具有重要的应用价值。

本研究采用溶剂萃取前处理结合超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS／MS），建立了人尿液中3，5，6-TCP的分析测定方法。方法操作简单、灵敏度高、准确性好、重现性强，并已成功应用于人尿液实际样品中3，5，6-TCP的测定，取得了满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

ACQUITYTM超高效液相色谱仪和Quattro Premier XE质谱仪（美国 Waters公司）；AG-285电子天平（瑞士 Mettler公司）；MG-2200氮吹仪（日本EYELA公司）；R-210旋转蒸发器（瑞士Buchi公司）；WH-3微型旋涡混合仪（上海楚定分析仪器有限公司）；高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）。

3，5，6-TCP和酮洛芬标准品（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇均为色谱纯，德国Merck公司。

1.2 标准工作溶液的配制

分别称取10mg（精确至0.1mg）3，5，6-TCP和酮洛芬标准品于10mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1000mg／L的标准贮备液，避光保存于4℃。用甲醇稀释标准贮备液至不同浓度，配制标准工作液。

1.3 样品前处理

准确吸取尿液10.0mL置于125mL分液漏斗中，加入内标物酮洛芬20μL（100mg／L）。加入20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯（20∶80，v／v）溶液，充分振摇萃取，重复一次。上清液移至鸡心瓶，旋蒸浓缩至约2mL，用移液器移至试管中。用提取溶剂清洗鸡心瓶2～3次，合并至试管中。于40℃水浴中氮气吹干，残留物以200μL的10%（体积分数）乙腈-水溶液涡旋30s溶解，经0.22μm膜过滤后待UPLCMS／MS分析。

1.4 UPLC-MS／MS条件

1.4.1 UPLC条件

色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1mm，1.7μm）；流动相A为乙腈，B为水。流动相的梯度洗脱程序为:0～2min，20%A～30%A；2～3min，30%A～40%A；3～4min，40%A；4～5min，40%A～30%A；5～6min，30%A～20%A。流速为0.3mL／min；柱温为25℃；进样量为5μL。

1.4.2 质谱条件

采用负离子模式的电喷雾电离（ESI-）；SIR（selective ion recording）方式扫描；毛细管电压:3.5 kV；离子源温度:120℃；脱溶剂气温度:350℃；锥孔反吹气流量:50L／h；脱溶剂气流量:600L／h；萃取器电压:3.0V；RF透镜电压:0.2V；低端分辨率1:15.0；低端分辨率2:15.0；高端分辨率1:15.0；高端分辨率2:15.0；离子能量1:0.5；离子能量2:0.5；碰撞气压力:0.343Pa；3，5，6-TCP定量离子:m／z198，定性离子:m／z196；酮洛芬定量离子:m／z 253.12；离子驻留时间:0.5s；锥孔电压:-30V。

2 结果与讨论

2.1 空白基质的选择

采用人工合成尿液进行试验，虽然本底较为干净，但是其中不含蛋白质，与实际尿液有一定的差距，不能有效反映人实际尿液基质的复杂性。而采用小鼠尿液作为空白基质，发现其存在较高的本底值，不适合测定方法的建立。因此，本实验通过对不同人的尿液进行筛选，选择无3.5.6-TCP干扰的人尿液作为空白基质。

2.2 前处理方法的优化

2.2.1 提取方式的选择

尿液是内源性物质较多的复杂生物基质，目前报道的尿液中有机物的痕量分析前处理大多采用固相萃取法（SPE）［10，11］。对于小鼠和人尿液中3，5，6-TCP的分析测定，有报道采用液液萃取法［7，8］。因此，本研究对固相萃取法和液液萃取法分别进行了尝试。分别使用极性较大的C8小柱（200mg，6 mL，美国 Waters公司）、Florisil小柱（500mg，6 mL，美国ProElut公司）和 HLB小柱（200mg，6 mL，美国 Waters公司）对尿液中的3.5.6-TCP进行提取，结果均未提取出来。这可能是因为在固相萃取过程中固相填料对3.5.6-TCP的吸附力不够大，当尿液样本通过吸附剂床时，3，5，6-TCP未能在其表面吸附。而选用有机溶剂液液萃取法进行前处理，结果发现乙酸乙酯可以将待测物3，5，6-TCP提取出来，但提取回收率并不是特别高。

2.2.2 提取溶剂的选择

分别用乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）和乙酸乙酯-乙腈（70／30，v／v）溶液作为尿液样本的提取溶剂，考察不同提取溶剂对待测物的提取效率。结果发现，二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液对待测物的提取回收率最高。由于3，5，6-TCP具有羟基结构，于是考察了酸化提取对回收率的影响。酸化提取中，加入一定量的浓盐酸调节尿液样本pH达到4，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液进行液液萃取。结果发现，酸化提取并未大幅度提高待测物的提取回收率，因此最终选用二氯甲烷-乙酸乙酯（20／80，v／v）溶液进行中性提取，这与3，5，6-TCP的pKa7.5的理化性质相一致［2］。

2.3 质谱条件的优化

采用ESI方式，分别考察了ESI／全扫描（full scan）在正、负离子模式下待测物峰的响应。结果发现，在负离子模式下3，5，6-TCP的基峰为［MH］-峰（m／z 198），而在正离子模式下未找到明显的碎片离子峰。运用子离子扫描（daughter scan）模式，以m／z198为母离子，结果未发现响应稳定且较强的碎片峰，这也与3，5，6-TCP的结构相符。因此，待测物的质谱检测定量离子为SIR模式下的m／z198。

在上述 UPLC-MS／MS 测定条件下，3，5，6-TCP和内标酮洛芬的保留时间分别为3.93和4.80 min，空白尿液样品无干扰。空白尿液、加标样品和实际样品的典型色谱图如图2所示。

图2 （a）空白尿液、（b）加标尿液和（c）实际尿样的色谱图Fig.2 Chromatograms of（a）a blank urine sample，（b）a spiked urine sample and（c）a real urine sample

2.4 工作曲线、检出限和定量限

精密吸取3，5，6-TCP标准工作液添加到10 mL空白尿样中，使尿液样本中3，5，6-TCP的质量浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4 mg／L。按1.3节前处理方法进行操作，在优化后的色谱及质谱条件下分析，记录3，5，6-TCP色谱峰面积（As）与内标色谱峰面积（Ar）。3，5，6-TCP与内标的峰面积比 R （R＝As／Ar）对质量浓度（C，mg／L）进行线性回归，回归方程为R＝0.09456C-0.00174，r2＝0.998。3，5，6-TCP在0.005～0.4 mg／L范围内色谱响应线性关系良好。在空白基质中添加目标化合物，以目标化合物3倍信噪比的加标水平为LOD，平行测定5次；以目标化合物10倍信噪比的加标水平为LOQ，平行测定5次。方法的LOD为0.41μg／L，LOQ为5μg／L。

2.5 加标回收率和精密度

配制质量浓度为10、20和200μg／L的3，5，6-TCP空白加标尿液样本各3份，分析结果如表1所示，3，5，6-TCP的平均回收率为95.33%～99.80%，相对标准偏差为1.60%～9.86%。

表1 3，5，6-TCP在尿液中的添加回收率（n＝3）Table 1 Recovery of 3，5，6-TCP spiked in a human urine sample（n＝3）

配制3，5，6-TCP 质量浓度为10、20和200 μg／L的空白加标尿液样本，按已确定尿液样品处理方法，同样操作、测定以及计算。在一个分析日内测定5次，计算日内精密度；在不同分析日（5d）制备并测定3个批次加标样本，计算日间精密度。结果表明，对尿液样品中3，5，6-TCP的分析精密度良好，RSD均小于15%（见表2）。

表2 日内和日间精密度试验数据Table 2 Results of intra-and inter-day precision tests

2.6 实际样品的处理和分析

采集了某农药厂附近居民的晨尿40份，包括幼龄儿童（20份）及其父亲或母亲的尿液。按1.3节实验方法处理样品，测定结果如表3所示。

表3 儿童和成人的尿液中3，5，6-TCP的分析结果Table 3 Analysis results of 3，5，6-TCP in children’s and adults’urine

结果表明，半数的儿童尿液中检出3，5，6-TCP，最高检出质量浓度为72.23μg／L；1／3的成人尿液中检测出3，5，6-TCP，最高检出质量浓度为83.50μg／L，反映出毒死蜱的人体生物负荷水平。毒死蜱的人体内暴露一方面可能与农药厂周边人群吸入了含有毒死蜱的大气有关，另一方面可能与食用了含毒死蜱残留的农作物有关。

3 结论

建立了超高效液相色谱-串联质谱方法，用于分析人体尿液中毒死蜱主要代谢产物3，5，6-TCP。验证结果表明该方法操作简单，灵敏度、准确度、精密度和定量分析线性关系均良好，已成功应用于实际测定某农药厂附近居民尿液中3，5，6-TCP的含量。该方法可以为毒死蜱的人体健康风险暴露评估以及其生物负荷的痕量监测提供有效的方法支撑，同时为揭示毒死蜱在体内的代谢方式和暴露途径，科学评价毒死蜱暴露水平与其代谢物之间的关系提供了研究基础。

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