超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱分析黄酮类化合物及小毛茛茎叶的成分

池玉梅， 李 瑶， 张 瑜，， 王琴霞， 崔小兵

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210023；2.中国药科大学，江苏 南京 211198）

液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术灵敏度高、选择性好，在复杂样品的低含量组分定量分析和已知成分定性鉴别方面有许多相关报道。然而，由于LC-MS技术的多样性及实验条件的多变性，在应用于组分未知的复杂样品的分析时，虽然陆续有化合物解析的报道［1-4］，但尚在规律探索中。

小毛茛（Ranunculus ternatus Thunb.）是毛茛科（Ranunculaceae）毛茛属（Ranunculus）植物，20世纪50年代发现于河南省信阳及驻马店地区，在我国长江中、下游以及台湾地区均有分布，在民间为全草入药应用，国内现有大量种植，其干燥块根为中国药典一部收载的中药材猫爪草（Radix Ranunculi Ternati）［5］，现代药理和临床研究均表明猫爪草及其制剂对肺结核、淋巴结核和多种癌症及淋巴瘤有显著疗效。前期研究显示，猫爪草的黄酮类成分为其有效成分，茎叶的总黄酮苷含量大于2%［6］，远高于块根中的0.2%［7］。本文采用超高效液相色谱／二极管阵列检测器-电喷雾四极杆串联飞行时间质谱（UPLC／DAD-ESI／Q-TOF MS），在研究黄酮类成分的色谱、质谱行为的基础上，对小毛茛茎叶的黄酮类成分进行解析，以期为小毛茛的药学研究提供基础，为LC-MS技术的应用拓展思路。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与药品

电喷雾离子源接口的四极杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF micro，美国 Waters公司）；超高效液相色谱（Acquity UPLC，美国 Waters公司）；光二极管阵列检测器（eλPDA，美国 Waters公司）；质谱工作站：Masslynx4.1。

甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），醋酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），盐酸（分析纯，上海中试化学试剂总公司），二次重蒸水（自制）。

对照品：木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、槲皮素（quercetin）、芦丁（rutin）、异槲皮苷（isoquercitrin）、槲皮苷（quercitrin）（中国药品生物制品检定所，含量测定用）；芹菜素（apigenin）、杨梅素（myricetin）（上海融禾医药科技有限公司，批号080531，含量大于98.5%）；二氢杨梅素（dihydromyricetin）、槲皮素-4′-O-葡萄糖苷（quercetin-4′-O-glucoside）（南京泽朗医药科技有限公司，含量大于98.5%）；夏佛托苷（schaftoside）、异夏佛托苷（isoschaftoside）、山柰酚-7-O-葡萄糖苷（kaempferol-7-O-glucoside）、槲皮素-7-O-葡萄糖苷（quercetin-7-O-glucoside）、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷（isorhamnetin-7-O-glucoside）（自制，归一化法含量大于98.5%）。对照品结构见表1。

小毛茛采于南京市周边地区，去根晒干（经南京中医药大学药用植物专家谈献和教授鉴定为真品）。

1.2 方法

1.2.1 黄酮对照品溶液

将各黄酮对照品配制为1g／L的甲醇贮备液，分析时用甲醇配制为0.5mg／L的混合溶液。

1.2.2 样品处理

小毛茛茎叶醇提液：称取0.5g小毛茛茎叶粉末（60目），置于具塞烧瓶中，加入70%（v／v）甲醇水溶液10mL，超声处理30min（工作频率40kHz，功率250W），取适量离心5min（12000r／min），取上清液，即得。

表1 黄酮对照品的结构Table 1 Structures of flavone references

酸水解液：取上述醇提液5mL，蒸除溶剂，加入5mL 1mol／L盐酸甲醇溶液回流水解，分别于水解15、30、120min取样，加适量 NaOH 中和，离心5 min（12000r／min），取上清液，即得。

1.2.3 色谱条件

Acquity UPLC HSS T3色谱柱（50mm×2.1 mm，1.7μm）；乙腈（A）和0.1%醋酸水溶液（B）为流动相，流速0.25mL／min；梯度洗脱程序：0～5 min为2.0%A～10%A，5～20min为10%A～20%A，20～30min为20%A～40%A，30～33 min为40%A；检测波长200～460nm；柱温30℃。

1.2.4 质谱条件

电喷雾离子化；负离子模式检测；检测范围m／z 60～1000；毛细管电压2800V；样品孔电压20V；MCP检测电压2200V；喷雾气流量50L／h，脱溶剂气流量450L／h；脱溶剂温度300℃，离子源温度110℃；一级质谱碰撞能量3V；二级质谱碰撞能量20～30V。

1.3 实验步骤

1.3.1 黄酮对照品的分析

取混合黄酮对照品溶液，按1.2.3节与1.2.4节的方法进行分析，提取色谱、光谱、质谱信息，分析与结构的关系。

1.3.2 小毛茛茎叶的分析

分别对小毛茛茎叶的醇提液和酸水解液进行UPLC-MS分析，提取符合黄酮类成分紫外光谱特征的对应离子峰，进行UPLC-MS／MS分析，提取色谱、光谱、质谱信息，根据实验结果，推测化合物。

2 结果与讨论

2.1 黄酮类化合物的色谱、光谱与质谱特性

2.1.1 保留时间

以［M-H］-为检测离子，选择m／z 319、563、285、269、463、609、447、477、317、301和315检测，黄酮对照品的UPLC-MS总选择离子色谱图见图1。

图1显示，在反相色谱中，保留时间与取代羟基及苷化的数目和位置具有相关性。

图1 黄酮对照品的UPLC-MS总选择离子色谱图（序号同表1）Fig.1 UPLC-MS chromatogram of total selective ions of flavone references（The numbers are the same as in Table 1）

对于同类化合物，苷元的羟基数目越多保留时间越小，如杨梅素（No.8，本节中化合物的序号均为表1中序号）、槲皮素（No.12）和山柰酚（No.15），保留时间依次在14.2、20.0和23.2min；再如木樨草素（No.13）和芹菜素（No.14），保留时间分别在20.5min和22.8min。在同分异构体苷元中，若C环3位上有游离-OH，因能与4位羰基形成分子内氢键，可使分子的疏水性增强，使保留时间增大，如山柰酚（No.15）与木樨草素（No.13），保留时间分别在20.5min和23.2min。

一般黄酮苷的保留时间小于相应苷元的保留时间。糖苷化数目越多保留时间越小，如对照品2、3为双取代糖苷，保留时间分别在6.7min和7.5 min，芦丁（No.5）是单取代二糖苷，保留时间在10.7min。

对于苷化位置，具有相同苷元的同分异构体糖氧苷，若A环7位苷化，则比C环3位苷化使分子的疏水性减小幅度更大，保留时间更小；若B环4′位苷化，因3-OH与4-羰基形成分子内氢键，使分子的疏水性减小的幅度小，因此保留时间为7位＜3位＜4′位，如对照品4、6和10，苷元均为槲皮素（No.12），分别为在7位、3位和4′位形成的葡萄糖氧苷，保留时间依次为10.6、11.6和14.5min。

此外，保留时间的大小与苷化糖基的关系与糖基的疏水性大小一致。如异槲皮苷（No.6）与槲皮苷（No.7），苷元与苷化位置均相同，糖基分别为葡萄糖与鼠李糖，保留时间分别为11.6min和13.7 min，前者疏水性小于后者。

2.1.2 紫外光谱特征

黄酮类化合物由桂皮酰基和苯甲酰基贡献形成吸收带Ⅰ和吸收带Ⅱ，其位置可以用于推测羟基的个数、位置和苷键的位置［8，9］。分析黄酮对照品的紫外光谱特征，结果显示与资料一致，均有两个特征吸收带。

黄酮苷元和相应黄酮碳苷的紫外吸收光谱相似，如夏腹托苷（No.2）和异夏腹托苷（No.3）是芹菜素（No.14）在6、8位形成的糖碳苷，其紫外光谱一致，吸收带Ⅰ在328～350nm之间（与B环的取代羟基数有关），吸收带Ⅱ在（266±5）nm；具有3位羟基的黄酮醇，其苷元的吸收带Ⅰ在（366±5）nm（与B环的取代羟基数有关），吸收带Ⅱ在250～270nm之间（与A环和B环的取代羟基数有关）；相应的黄酮醇苷为3-OH取代苷化时，则吸收带Ⅰ蓝移至（350±5）nm，吸收带Ⅱ变化不大；而游离3-OH的黄酮醇苷相似于相应的苷元，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（No.4）与槲皮素（No.12）、山柰酚-7-O-葡萄糖苷（No.9）与山柰酚（No.15）、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷（No.11）与异鼠李素（No.16），均有一致的光谱特征。二氢杨梅素（No.1）为二氢黄酮，无吸收带Ⅱ，仅在290nm有吸收。

2.1.3 二级质谱碎片

依据苷元、苷化数目及位置的代表性，图2给出了部分对照品的LC-ESI／Q-TOF的二级质谱图。结果显示，黄酮碳苷和氧苷的LC-MS／MS裂解形式有显著差异，黄酮苷元与黄酮醇苷元的二级质谱裂解形式也有一定差异，且母离子和脱糖基子离子的相对丰度与黄酮氧苷的苷化位置有一定的相关性。

有关黄酮氧苷的LC-MS／MS规律，陆续有文献报道［1-4］。池玉梅等在文献［10］中曾有探讨，黄酮氧苷表现为丢失糖残基，如六碳糖苷、五碳糖苷、甲基五碳糖苷和六碳糖醛酸苷分别为丢失162、132、146和176u。对于黄酮碳苷，六碳与五碳糖苷呈现的二级质谱裂解规律分别为［M-H-90］-、［MH-120］-和［M-H-60］-、［M-H-90］-，如夏腹托苷（No.2）和异夏腹托苷（No.3）（图2No.2、No.3），与相关报道［3，4］一致。

黄酮苷元的质谱有2种裂解方式［8，9］，且以裂解方式Ⅰ（相当于逆Diels-Alder（RDA）裂解）为主，即断裂主要发生在C环的1位与2位和3位与4位，形成A1与B1两个特征离子。实验结果显示，黄酮苷元的LC-MS／MS裂解形式与之基本一致，如：木樨草素（图2No.13）主要裂解为：C7H3（m／z 151）与 B-1：C8H5（m／z 133）；芹菜素（图2 No.14）主要裂解为：C7H3（m／z 151）与：C8H5O-（m／z 117）；此外，LC-MS／MS尚有［M-H-CO-O］-：No.13 有 m／z 241（C14H9O-4）、No.14有 m／z 225（）；m／z 107（）为［A1-CO-O］-。

黄酮醇苷元的质谱以裂解方式Ⅱ为主进行裂解，［B2-28］-离子为其特征离子［8，9］。本实验结果显示，黄酮醇苷元的LC-MS／MS裂解形式与之不完全相符，且与B环的羟基数有关，若B环3′与4′位均存在羟基，其裂解主要发生在C环的2位与1位、3位间，随之3位脱去CO。池玉梅等［10］曾依据高分辨质谱的特点进行了解析，如槲皮素（图2No.12），主要裂解形成 A-：C8H3（m／z 179），脱CO成C7H3（m／z 151）与B-：C7H5（m／z 121）。若B环仅有单取代羟基，则LC-MS／MS裂解形式多样，主要发生于C环脱CO方式，如山柰酚（图2 No.15）和异鼠李素（图2No.16），经高分辨质谱检索子离子化学组成和裂解形式推测见表2。羟基被甲基化的苷元，其裂解首先发生在脱甲基，如异鼠李素（图2No.16）。

图2 黄酮对照品的二级质谱图Fig.2 MS／MS spectra of flavone references

高分辨质谱不能分辨同分异构体，MS／MS在解析结构相近的黄酮糖苷同分异构体时，若仅利用质荷比信息，仍不能得以分辨，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（图2No.4）、异槲皮苷（图2No.6）和槲皮素-4′-O-葡萄糖苷 （图 2No.10），［M-H］-均为C21H19（m／z463），均有m／z301（300）、179的碎片离子。但观察黄酮糖氧苷同分异构体的二级质谱图可发现，在相同的分析条件下，黄酮醇糖氧苷的母离子与苷元离子的相对丰度比例与糖苷化位置具有相关性。若苷化在黄酮醇A环的7位，其母离子［M-H］-的相对丰度最高，如槲皮素-7-O-葡萄糖苷（图2No.4）的m／z 463的相对丰度最高、异鼠李素-7-O-葡萄糖苷（图2No.11）的m／z 477的相对丰度最高；若苷化在黄酮醇B环，其苷元离子［M-H-gly］-的相对丰度为最高，如槲皮素-4′-O-葡萄糖苷（图2No.10）的m／z301的相对丰度最高；若苷化在黄酮醇C环3位，其苷元离子以［M-2H-gly］-的相对丰度为最高，且存在如下现象：苷元离子同时呈现［M-H］-与［M-2H］-，相对丰度后者高于前者，如芦丁（图2No.5）、异槲皮苷（图2 No.6）中m／z300均高于m／z301的相对丰度。

2.2 小毛茛茎叶成分解析

依据飞行时间质谱能够得到精确质量数的特点，检索母离子［M-H］-与碎片离子的化学组成。采用离子质量数与计算质量数相对误差较小的原则（误差小于5×10-6），结合考虑UV光谱图与不饱和度的合理性，检索化学式。小毛茛茎叶醇提液的各化合物的保留时间、紫外最大吸收波长、二级质谱碎片及可能的化学式见表3，其中母核同表1的III结构，R3″和 R4′均为 H。

图3O-1、A-1分别为小毛茛茎叶醇提液总离子流图和选择离子色谱图。

表3 小毛茛黄酮类成分的LC／DAD-MS数据及推测结果Table 3 LC-／DAD-MS data of flavonoids in Ranunculus ternatus Thunb.and identified results

表3 （续）Table 3 （Continued）

图3 样品醇提液及其酸水解液的UPLC-MS色谱图Fig.3 UPLC-MS chromatograms of the alcohol extract solution and its acid hydrolysis solutions of sample

根据二级质谱信息，比对对照品的LC-MS／MS信息，推测小毛茛茎叶醇提液中含有3类黄酮醇苷元形成的糖氧苷类化合物，苷元分别为槲皮素（m／z 301）、异鼠李素（m／z 315）和山柰酚（m／z 285）；根据紫外光谱信息和二级碎片离子的相对丰度，推测3位均为氧苷。

参考黄酮醇糖氧苷的一般水解条件［11］，考察不同水解时间的溶液，验证苷元及苷化位置，酸水解液的LC-MS色谱图见图3中O-2～O-4、A-2～A-4。同法解析LC-MS、LC-MS／MS测试结果，根据黄酮糖氧苷水解脱糖基时间与糖苷位置的相关性［8］推测15min和30min水解液中均含有非3位苷化的黄酮；根据紫外光谱信息和二级碎片离子的相对丰度推测15min和30min水解液中含有在7位成氧苷的化合物，并且均为六碳糖苷（图3中A-3）；120 min水解液的UPLC-MS测试结果显示水解完全，符合7位苷化的特征；水解液测试结果显示均含有槲皮素、异鼠李素和山柰酚；采用薄层色谱方法（具体实验步骤略）鉴定到水解液中还含有葡萄糖和鼠李糖糖基。

以表2中的1号化合物为例，紫外光谱有特征吸收带254nm和348nm；母离子为m／z771，高分辨质谱解析得化学式为C33H40O21；二级质谱有槲皮素苷元的特征碎片m／z 301、179、151；根据子离子m／z609、463，分析可得（771-609）＝162、（771-463）＝308，分别为葡萄糖残基与葡萄糖-鼠李糖残基，两者之和等于母离子与苷元之差（470u），结合m／z463与m／z462同时存在，且具有后者相对丰度高于前者的现象，推测C环3位连接葡萄糖-鼠李糖基，A环7位连接葡萄糖基，为双取代糖氧苷，结合水解液的分析结果，推测1号化合物为槲皮素-3-O-葡萄糖-鼠李糖-7-O-葡萄糖苷。

以此类推解析其他化合物，结果见表3，包括22个黄酮醇糖苷和3个苷元，与对照品4～7、9～12、15～16具有相对应的苷元，相应的糖苷化位置。

3 结论

采用LC-MS技术，利用对照品的色谱、质谱特性，可以鉴别黄酮类成分同系物和一些同分异构体，方法简便。药用植物小毛茛的茎叶含有丰富的黄酮类成分，可研究其潜在的药用价值。本文仅就黄酮醇糖苷的色谱、质谱特性进行了初步探索，有关的规律及其应用尚有待研究。

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