RP－HPLC法测定人血草中黄连碱和白屈菜红碱的含量

徐 帮 郭玲芝 程 凡 汪鋆植 邹 坤

（天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学），湖北 宜昌 443002）

人血草Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde是罂粟科金罂粟属植物，又名豆叶七，人血七、野人血草、大金盆.产湖北西部、陕西南部和四川东部.以全草入药，有活血、调经、舒筋、散淤、止痛等功效，用于月经不调，跌打损伤［1－2］.人血草作为民间药在湖北省及周边民间应用历史悠久，范围广范.本实验室前期对人血草药材的显微特征、理化鉴别、水分、总灰分、酸溶性浸出物、醇溶性浸出物进行了相关质量标准的研究［3］.研究表明，人血草的主要化学成分为四氢黄连碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连碱别隐品碱、原阿片碱等生物碱类化合物.其中黄连碱和白屈菜红碱的含量较大，且为其主要的生理活性成分［4－5］.本文采用高效液相色谱法，对人血草药材中黄连碱和白屈菜红碱进行了含量测定，通过试验分析，结果表明该方法简单、准确、重现性好，可作为质量控制的方法.

1 仪器与试药

1.1 仪器

Varian210分析型高效液相色谱系统210型二元梯度泵，210型紫外检测器，美国 Varian公司；ME215S型1／10万电子天平，德国Sartorius公司；S－3100紫外分光光度计，韩国Sinco公司；旋转蒸发仪，日本EYELA.

1.2 试剂与试药

黄连碱和白屈菜红碱均为本实验室自人血草中分离并鉴定，以HPLC面积归一法测定其纯度数大于98%；甲醇和乙腈为色谱纯，水为高纯水，其它试剂均为分析纯.人血草全草分别采集自中国湖北省神农架、五峰、长阳，经本实验室杨进副教授鉴定为Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde.原植物及药材标本现保存于天然产物研究与利用湖北省重点实验室（三峡大学）.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

YMC－Pack ODS－AA色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流速1.0mL·min－1；检测波长280nm；进样量20μL；柱温30℃；流动相为乙腈（B）－水相（0.2%磷酸＋0.2%三乙胺）（A）梯度洗脱，0～1min，20%B，80%A；1～10min，40%B，60%A；10～20min，50%B，50%A；20～30min，100%B.

2.2 试验溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取对照品黄连碱6.62mg和白屈菜红碱3.18mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品贮备液.以0.22μm微孔滤膜过滤，低温避光保藏备用.

2.2.2 供试品溶液的制备

取人血草药材粉末（过40目筛，50℃烘干）约3.0 g，精密称定，置于250mL圆底烧瓶中，加入6倍量的95%乙醇溶液，加热回流2次，每次60min，收集醇溶液，蒸干，残渣用50mL三蒸水溶解，用0.1mol·L－1磷酸调pH至3～4，静置过夜，过滤，用0.1mol·L－1氢氧化钠溶液调pH至7～8，用等量氯仿萃取3次，收集氯仿液，回收氯仿，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，摇匀，定容，得供试品溶液.以0.22μm微孔滤膜过滤，低温避光保藏备用.

对照品以及供试品的色谱图如图1所示.

图1 对照品和供试品的HPLC图

2.3 线性关系试验

分别吸取对照品贮备液0.2，0.4，0.6，1，2，4mL置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，按2.1项下色谱条件测定，各进样20μL，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，以黄连碱和白屈菜红碱的浓度（X）为横坐标，进行线性回归.黄连碱和白屈菜红碱的回归方程分别为:

2.4 精密度试验

精密吸取对照品贮备液6份，按2.1项下色谱条件连续进样，进样量20μL，每个浓度进样3次，测定黄连碱和白屈菜红碱的色谱峰面积，计算RSD（n＝6）分别为1.8%，1.6%.

2.5 重复性试验

取人血草药材粉末5份，每份约3.0g，精密称定.按2.2.2项下方法平行制备，按2.1项下色谱条件进行分析，测定黄连碱和白屈菜红碱的色谱峰面积，计算RSD（n＝5）分别为2.5%，2.3%.

2.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液20μL，分别于0，4，12，24，36，48h进样分析，测定黄连碱和白屈菜红碱的色谱峰面积，计算 RSD（n＝6）分别为1.3%，1.2%，结果表明48h内供试品溶液稳定性良好.

2.7 回收率试验

取已知含量的样品6份，每份约2.0g，精密称定.各样品分别加入对照品贮备液适量，按2.2.2项下方法平行制备，按2.1项下色谱条件，分别进样20 μL进行测定.计算回收率结果见表1.

表1 黄连碱和白屈菜红碱加样回收率（n＝6）

2.8 样品测定

取不同产地的人血草药材各3份，每份约3.0g，精密称定，按2.2.2项下方法平行制备，按2.1项下色谱条件进样分析测定，根据标准曲线计算样品中黄连碱和白屈菜红碱的质量分数.结果见表2和表3.

表2 不同产地人血草样品中黄连碱质量分数

表3 不同产地人血草样品中白屈菜红碱质量分数

3 讨 论

为了能在适宜的分析时间内获得指标成份的完全分离，在实验中对流动相体系进行了反复摸索，分别用甲醇－水、乙腈－水、乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水、乙腈－三乙胺水、乙腈－磷酸－三乙胺水等体系进行洗脱，发现甲醇－水洗脱基线不平稳，分离度差，乙腈－醋酸水、乙腈－磷酸水和乙腈－三乙胺水的分离效果同乙腈－水体系的分离效果相比并没有进一步改善，而以乙腈－磷酸－三乙胺水为最佳，黄连碱和白屈菜红碱的峰形较好，分离度较高.本实验采用的供试品溶液为氯仿萃取的粗提液，为保护色谱柱选用流动相梯度洗脱，可将强保留物质洗脱下来.

氯仿萃取之前的pH为7～8，若溶液pH过高，碱性太强容易产生乳化现象，对生物碱的提取不利.

本试验同时测定黄连碱和白屈菜红碱，在选定的色谱条件下，方法的精密度及重复性良好，稳定性强，准确度高，故可作为人血草药材质量控制的标准.

［1］中国科学院中国植物编辑委员会.中国植物志:第32卷［M］.北京:科学出版社，1999.

［2］方志先，廖朝林.湖北恩施药用植物志（上）［M］.武汉:湖北科学出版社，2006:383.

［3］朱靖静，杨 进，邹 坤，等.人血草质量标准研究［J］.中国民族民间医药，2009，15:22－24.

［4］Slavik J，Hanus V，Slavikova L.Alkaloids of the paraveraceae.91.Alokaloids from Stylophorum lasiocarpum（Oliv.）Fedde［J］.Collection of Czechoslovak Chemical Communications，1991，56（5）:1116－1122.

［5］中华本草编委会.中华本草:第9卷［M］.上海:上海科学技术出版社，1999:672.