HPLC 法测定马钱子缓释片中士的宁与马钱子碱

陈晓莉，李永吉，王录娜，孙佳琳，刘 婷，管庆霞

(黑龙江中医药大学 北药基础与应用研究省部共建教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

马钱子为马钱科植物马钱(Strychnos nux－vomica L.)的干燥成熟种子，收载于中国药典2010年版一部［1］，具有通络止痛、散结消肿［2－5］的功效.近年研究表明［6－10］马钱子总生物碱有抗炎、抗心律失常、抗血小板聚集、免疫调节以及抗菌、镇痛、抗肿瘤等作用.马钱子总生物碱中的士的宁和马钱子碱既是活性成分又是毒性成分，故要保证马钱子的临床疗效，必须确保士的宁、马钱子碱的质量浓度以达到既能降低毒性又最大限度保留有效成分［11］.所以本文着重研究了HPLC 法测定马钱子总生物碱的有效成分士的宁和马钱子碱的质量浓度，结果显示该方法简便、灵敏、专属性强，准确可靠，可为考察本品的质量与稳定性提供参考，同时为研制中药缓释制剂奠定了科学基础.

1 仪器与试药

美国 Waters 公司高效液相色谱仪(2996Photodiode Array Detector、2695 Separation Module、Empower 色谱工作站);AB265－S 电子分析天平(德国梅特勒公司);超声波发生器(浙江象山石浦海天电子仪器厂).

士的宁、马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所);甲醇(美国Dikma 公司)为色谱纯;重蒸馏水(自制);其他试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适应性考察

2.1.1 色谱条件

谱柱:Diamonsil C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇－水－乙酸－三乙胺(76∶230∶2.4∶0.3);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:30 ℃.色谱图见图1.

图1 马钱子总生物碱高效液相色谱图

2.1.2 系统适应性考察

以士的宁的色谱峰计算，理论塔板数不少于3 000，对称因子为0.95～1.05，士的宁相临组分的分离度R≥1.5，满足样品分析检测要求.

2.2 专属性考察

按马钱子总生物碱缓释片处方中辅料的配比称取各辅料，充分混合后得不含马钱子总生物碱的空白辅料，称取相当于处方中一片剂量的空白辅料，用900 mL 释放介质溶解，超声混匀，得到空白辅料溶液.取马钱子总生物碱缓释片3 片，用研钵研成细粉，充分混合后称取相当于处方中一片剂量的粉末，用900 mL 释放介质溶解，超声混匀，得到缓释片溶液.分别取两种溶液适量，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，注入液相色谱仪.由图可见，马钱子总生物碱主要成分分离良好，空白释放介质不干扰测定.

2.3 供试品溶液的制备

取马钱子生物碱缓释片10 片，研成细粉末，称取适量粉末加蒸馏水100 mL，超声5 min 溶解，过滤，续滤液备用.

2.4 对照品溶液的制备

称取士的宁、马钱子碱对照品约2.4、2 mg，精密称定，置同一50 mL 量瓶中，蒸馏水至刻度，超声5 min 溶解，作为对照品贮备液备用.

2.5 标准曲线的建立

分别将2.1 项下的对照品贮备液用蒸馏水稀释成质量浓度不同的系列混合对照品溶液，超声充分溶解，其中士的宁的质量浓度分别为1.2、2.4、4.8、9.6、14.4 μg/mL;马钱子碱的质量浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、12.0 μg/mL，进样40 μL，在上述色谱条件下分离测定，记录色谱图与峰面积.以峰面积(A)为纵坐标，对照品质量浓度(C)为横坐标作图，得标准曲线.士的宁:A=68 806C－32 976，r=0.9999;马钱子碱:A=35 889C－14 337，r=0.9998 结果表明，士的宁在1.2～14.4 μg/mL，马钱子碱在1.0～12.0 μg/mL 质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，见图2.

图2 高效液相色谱图

2.6 精密度试验

精密吸取同一质量浓度的对照品溶液40 μL，连续进样6 次，记录峰面积并计算质量浓度.结果士的宁的RSD为0.57%(n=6)，马钱子碱RSD为1.15%(n=6)，表明精密度良好.

2.7 稳定性试验

取马钱子生物碱缓释片供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h 进行测定，结果士的宁的RSD为1.12%，马钱子碱RSD为1.02%，表明供试品溶液在24 h 内基本稳定.

2.8 准确度试验

精密吸取供试品溶液适量置10 mL 量瓶中，加入对照品溶液贮备液0.5、0.8、1.0 mL，蒸馏水稀释至刻度，摇匀，进样分析，记录色谱图，计算回收率，结果见表1、2.

表1 士的宁的准确度试验数据

表2 马钱子碱准确度实验数据

2.9 样品处理方法的考察

考察了蒸馏水为溶剂，超声时间对马钱子生物碱缓释片中士的宁、马钱子碱提取的影响，通过测定不同时间超声时间所得制剂中有效成分的质量浓度变化，确定将制剂中有效成分提取完全的条件.

取马钱子生物碱缓释片10 片，用研钵研细，精密称取一定量的粉末(含主药5 mg)3 份，置100 mL 量瓶中，加入蒸馏水至刻度，分别超声5.0、10.0、15.0 min 使待测组分充分溶解.用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液40 μL 注入液相色谱仪，计算质量浓度，考察不同超声时间对待测组分溶解的影响.结果见表3.

表3 样品处理方法影响结果

由表3 可知，超声5 min 即能使待测成分完全溶解，可拟定超声时间为5 min.

2.10 样品中士的宁、马钱子碱质量浓度测定方法及结果

分别取三批缓释片20 片，用研钵研细，精密称取一片缓释片重量的粉末，加蒸馏水900 mL，超声5 min 使主药充分溶解后加蒸馏水至刻度，摇匀，以0.45 μm 微孔滤膜过滤，续滤液作为供试液.取供试液40 μL 于进样，记录峰面积，计算3 批样品质量浓度，测定结果见表4.

表4 马钱子缓释片中士的宁和马钱子碱的质量浓度

三批缓释片中士的宁、马钱子碱平均每片质量浓度分别为8.10、6.78 mg.

3 讨论

实验曾以乙腈－0.01 mol/L 庚烷磺酸钠与0.02 mol/L 磷酸二氢钾等量混合溶液(10%H3PO4调pH值为2.8)为流动相，虽然也能使士的宁、马钱子碱与其他组份完全分离，但色谱柱柱效降低.最终选择的流动相未使用磷酸盐和价格较高的乙腈，有利于延长色谱柱的使用寿命.流动相选择甲醇－水－乙酸－三乙胺(76∶230∶2.4∶0.3)，基线稳定，峰形良好，可获得较好的分离效果，保留时间较适宜.流动相中加入了有机碱三乙胺，不但可以调节生物碱的保留时间以期与其他组分分离，亦是硅基固定相的扫尾剂，它的加入对士的宁与马钱子碱的分离状况尤为重要.

马钱子中的主要成分为生物碱类化合物，其质量浓度为质量控制的主要内容.鉴于中药的广泛性和成分复杂性，必须从原料购得开始到制成成品的过程中进行全面的质量浓度质量控制.为此，特建立了马钱子总生物碱原料药主要成分质量浓度测定方法HPLC 方法，马钱子生物碱缓释片中主要成分的HPLC 方法，这种原料―成品的质量控制方式可较全面的控制马钱子生物碱缓释片的质量，方法稳定，结果准确.马钱子总生物碱以士的宁、马钱子碱为指标成分进行质量浓度测定的，主要原因是二者为马钱子的主要有效成分亦即主要毒性成分.《中国药典》及文献记载以通过测定士的宁、马钱子碱的质量浓度来评价马钱子及其各类炮制品、制剂质量.故要保证马钱子的临床疗效，必须确保士的宁、马钱子碱的质量浓度以达到既能降低毒性又最大限度保留有效成分.所以士的宁和马钱子碱质量浓度如何，直接关系到患者的用药安全，可作为药材质量首先考查的指标.利用这种检测主要成分质量浓度的质控达到全面控制马钱子生物碱缓释片质量的目的.

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部［M］.北京:化学工业出版社，2010:47.

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