心肌梗死后大鼠periostin蛋白表达量与瑞舒伐他汀干预作用研究

张娟 崔天祥 李莉

心肌梗死后大鼠periostin蛋白表达量与瑞舒伐他汀干预作用研究

张娟 崔天祥 李莉

目的观察心肌梗死后大鼠periostin(Pn)表达与瑞舒伐他汀的作用关系，探讨瑞舒伐他汀在梗死后心肌重构中的作用机制。方法雌性54只远交群(SD)大鼠，随机分为正常对照组、模型组、瑞舒伐他汀组,每组18只。其中36只(SD)大鼠，结扎左前降支建立急性心肌梗死模型，随机分为急性心肌梗死(AMI)对照组和瑞舒伐他汀(ROS)干预组；另18只为假手术组(Sham)，只穿线不结扎。ROS组大鼠以6 mgROS/(kg·d)灌胃，另两组以等量清水灌胃。4周后测定各组大鼠胶原容积分数(CVF)、periostin蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表达量。结果与AMⅠ组相比，ROS组心肌CVF、periostin 蛋白及TGF-β1和periostin-mRNA表达量均显著降低(P<0.05)，ROS组和AMⅠ组相关指标均显著高于Sham组(P<0.05)。结论瑞舒伐他汀能够显著降低受损心肌中periostin表达水平，可能是其改善心肌重塑的机制之一。

瑞舒伐他汀；心肌梗死；Periostin；大鼠

心肌梗死后心室重塑是个复杂的病理生理过程，是心力衰竭持续发展进程中极其重要的环节。在多种参与心室重塑的因素如神经体液因素、炎症因子等的作用下，主要来源于心脏成纤维细胞的肌成纤维细胞(myofibroblast, MyoFBs)在以胶原沉积和间质纤维化为主要特征的基质重塑中，发挥了重要的调节作用。肾素-血管紧张素系统与肌成纤维细胞交互作用，对胶原代谢和间质纤维化起到重要的调控作用。因此，心肌梗死后肌成纤维细胞已经成为控制纤维化进展的重要靶细胞。对肌成纤维细胞的增殖及分化进行干预是治疗心肌间质纤维化、防止心室重塑的可行途径。

鉴于periostin的病理性促纤维化与血管新生作用，越来越多的研究者已经开始关注它在心血管疾病中的特殊功能。如何有效干预由其介导的细胞外基质沉积，对逆转心肌梗死后心室重塑具有重要意义。本研究拟在利用瑞舒伐他汀调脂以外的作用，观察其对急性心肌梗死后periostin的干预效果，探讨其改善心肌重塑的机制，为利用瑞舒伐他汀改善急性心肌梗死后心肌重塑提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要材料 瑞舒伐他汀片(阿斯利康制药有限公司)；SP9000试剂盒(北京中杉生物工程公司)；DAB试剂盒(北京中杉生物工程公司)；RT-PCR 试剂盒(Transgene公司)；引物由北京博大泰克公司合成。periostin兔多克隆抗体(上海萨博生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1动物模型的建立及分组 选取8周龄SD雌性大鼠，体重255～306 g，由郑州大学实验动物中心提供。随机分3组每组各18只大鼠，假手术组：只在左前降支相应部位穿线。急性心肌梗死模型组：按文献[1]的方法结扎左前降支建立。术后给予青霉素40万U/(kg·d)预防感染，共3 d。术后24 h将急性心肌梗死大鼠随即分为AMI对照组和ROS 干预组。ROS组每只老鼠以6 mgROS/(kg·d)溶于1 ml清水中灌胃，AMⅠ组和Sham组以1 ml清水灌胃。实验大鼠均自由饮食。4周后颈椎脱臼法处死动物，摘取心脏，在梗死区沿左心室长轴一分为二，取梗死交界区组织，一部分10%甲醛固定后常规石蜡包埋切片，行病理镜检；一部分液氮保存，留做RT-PCR行periostin蛋白表达测定。

1.2.2Masson染色测定心肌胶原容积分数(CVF) 切片脱蜡，Masson染色法将胶原纤维染成绿色，心肌染为红色，在光学显微镜下(×400)随机选择5个视野进观察，使用图像分析软件(Biosens Digital Imaging System v1.6)分析，CVF的计算方法为：胶原面积/总面积。

1.2.3免疫组化检测心梗交界区periostin的表达(SP法)免疫组化染色梗死交界区心肌组织，最后经DAB显色、苏木素复染后，阳染产物胞质呈棕黄色或棕褐色。各组图片应用分析软件(Biosens Digital Imaging System v1.6)进行图像分析，随机取5点测量，取平均值。阳性产物强度用图像处理系统灰度值表示。

1.2.4RT-PCR检测心梗交界区periostin mRNA的表达 用Trizol试剂处理梗死交界区心肌组织(约110 mg)提取总RNA。使用逆转录酶将8 μL总RNA合成cDNA。扩增Periostin序列上游引物：5’ ACTCCGTGTCTTCGTGTATC 3’，下游引物：5’ CTTTCTTCATTAGTCATTCCCT 3’，扩增片段为279bp；扩增TGF-β1序列上游引物：5’ CCCACTGATACGCCTGAG 3’，下游引物：5’ GGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3’，扩增片段为469bp；内参GAPDH序列上游引物：5’ AAGTTCAACGGCACAGTCAA 3’，下游引物：5’ TCCACGACATACTCAGCACC 3’，扩增片段为128bp。取2 μl逆转录产物分别应用各组上下游引物进行 PCR扩增。扩增条件如下：94 ℃预变性2 min，1个循环；94 ℃变性30 s，退火30 s (periostin为52 ℃，TGF-β1为54 ℃，GAPDH为 55 ℃)，72 ℃延伸2 min，共35个循环； 72 ℃总延伸 5 min。取 5 μL PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察电泳条带，D-140图像记录分析系统进行分析，检测因子mRNA的表达量及DNA条带和GAPDH 的DNA条带灰度值比值计算。

2 结果

2.1各组CVF及periostin蛋白表达量的比较 Masson染色显示：Sham组有极少量胶原纤维形成，AMⅠ组大量胶原纤维形成，ROS组介于两者之间；免疫组化染色结果显示：AMⅠ组大鼠心肌细胞胞质中periostin表达量最多，ROS组相对减少；AMⅠ组及ROS组CVF、periostin蛋白均显著高于Sham组(P<0.05)，ROS组CVF、periostin蛋白与AMⅠ组相比均显著降低(P<0.05)，见图1及表1。

图1 各组大鼠心肌组织的免疫组化染色(SP染色法，×400)

注：A:Sham组；B: AMⅠ组；C: ROS组

2.2各组periostin mRNA表达的比较 AMⅠ组和ROS组与Sham组相比较，TGF-β1及periostin mRNA的表达均显著增加(P<0.05)；ROS组与AMⅠ组相比，TGF-β1及periostin mRNA的表达均显著减少(P<0.05)，见图2及表2。

图2 各组大鼠心肌组织periostin mRNA的表达(RT-PCR)

注：A:periostin mRNA的表达；B:TGF-β1 mRNA的表达。

M:DAN maker；1：假手术组；2：AMⅠ组；3：ROS组

表1 瑞舒伐他汀对CVF、periostin蛋白的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与心肌梗死组比较，△P<0.05

表2 瑞舒伐他汀对periostin、TGF-β1 mRNA的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05；与AMⅠ组比较，△P<0.05

3 讨论

在心肌梗死发生直至坏死心肌被纤维组织替代这一过程中，肌成纤维细胞是梗死区域中主要的细胞类型，肌成纤维细胞通过增强的迁移、增殖及分泌活性增加胶原的产生，促进细胞外基质间的交联，在促进损伤部位愈合和瘢痕组织形成的同时，引起胶原的过度沉积，纤维化的增加使心室的顺应性下降，重塑明显，导致心肌僵硬度增加和舒缩功能障碍,最终心力衰竭必然会出现。心肌梗死后肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)激活，Ang-Ⅱ可以刺激成纤维细胞等分泌转化生长因子(TGF-β1)，引起胶原合成增多。体外实验证实，TGF-β1诱导胶原分泌增加，使大鼠心脏成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原mRNA表达增高。

Periostin是一种细胞外基质蛋白，主要由成纤维细胞分泌，通过抑制心肌细胞扩散及成纤维细胞的黏附造成心肌肌束滑动进而导致心腔扩大和心功能受损[2]。损伤、压力负荷、应激、炎症等均可引起Periostin蛋白表达上调。periostin蛋白可与胶原-I、胶原-V、 粘连蛋白等基质蛋白结合参与生理性及病理性纤维化的形成[3]。Iekushi等[4]在急性心肌梗死大鼠中使用缬沙坦治疗后发现，缬沙坦可通过抑制 periostin表达来改善心功能及心肌梗死后心室重塑。

许多研究表明，他汀类药物除降脂外，还有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗增殖抗氧化应激、抗血检形成、抑制新生血管形成等多重作用，目前被认为是治疗冠心病及预防冠脉成形术后再狭窄的理想药物。但他汀类药物抑制VSMC增殖、迁移及血管再狭窄的机制仍未完全明了，他汀类药物是否能通过抑制Pn表达而进一步抑制心室肌重构尚未见报道。然而他汀类药物对AMI后心室重构的影响是否也与periostin表达有关，目前仍未见报道。

本研究以检测心肌periostin的变化来反映瑞舒伐他汀的抗心肌重构作用。结果发现：与AMⅠ组相比，ROS组心肌periostin、TGF-β1表达明显降低，胶原容积分数降低。实验结果证实瑞舒伐他汀能够降低梗死交界区心肌periostin的表达，可改善急性心肌梗死后心肌重塑，其机制可能为瑞舒伐他汀通过降低TGF-β1的水平，调节periostin的表达，从而减少胶原的沉积，这为治疗急性心肌梗死后心室重构提供了实验依据，但深入的其他机制尚待进一步探讨。

[1] 王勇, 高大中, 殷跃辉, 等.大鼠心肌梗死模型建立方法选择及心电图表现.中国实验动物学报,2011,19(6):525-529.

[2] KATSURAGI N, MORISHITA R, NAKAMURA N, et al.Periostin as a novel factor responsible for ventricular dilation. Circulation, 2004, 110(13):1806-1813.

[3] ZHOU HM, WANF J, ELLIOTT C, et al.Spatiotemporal expression of periostin during skin development and incisional wound healing: lessons for human fibrotic scar formation. J Cell Commun Signal, 2010, 4(2):99-107.

[4] IEKUSHI K, TANIYAMA Y, AZUMA J, et al.Novel mechanisms of valsartan on the treatment of acute myocardial infarction through inhibition of the antiadhesion molecule periostin. Hypertension, 2007,49 (6):1409-1414.

Effectsofrosuvastatinonexpressionofperiostinproteininratswithacutemyocardialinfarction.

ZHANGJuan,CUITian-xiang，LILi.

CardiovascularDepartment,TheSecondaffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou, 450014,China.

ObjectiveTo evaluate the effects of rosuvastatin on expression of periostin (Pn)protein in rats with acute myocardial infarction and to investigate the improvement of myocardial reconstruction mechanism.MethodsFemale adult SD rats were randomly divided into sham group, model group and benazepril group (18in each group). Thirty-six female SD rats with ligated LAD were used to establish models of acute myocardial infarction (AMI), twenty four hours later, the models were randomly divided into acute myocardial infarction (AMI) as control group and rosuvastatin intervention (ROS) group.Another 18 rats were tested with pierced but not ligated LAD as sham-operated group (Sham). Rats in ROS group were given rosuvastatin by gavage at 6 mg/(kg·d) dose levels to soluble in 1 ml clear water, whereas rats in the other two groups were given 1 ml clear water each day. Four weeks later, compare the differences of collagen volume fraction (CVF), periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA.ResultsMyocardial CVF, periostin protein, TGF-β1 mRNA and periostin mRNA were reduced in the ROS group compared with rats in the AMI group (P<0.05), both ROS group and AMI group were significantly higher than those in the Sham group (P<0.05).ConclusionRosuvastatin can reduce the expression of periostin in the damaged myocardial, may be one of the mechanism of myocardial remodeling improvement.

Rosuvastatin; Myocardiac infarction; Periostin; Rat

450014 郑州大学第二附属医院心内科

张娟 E-mail：doczj@hotmail.com