微小RNA 30c增加有氧运动训练小鼠心室顺应>性的研究

贾明学，张国海，李 艳，董国忠，桑国强，杨宏兴

心脏是人体循环系统中的重要器官，主要功能是提供动力将血液运行至身体各器官和组织。心脏功能的有效运转是人体运动的基础，也是运动员完成高强度运动、获得优异成绩的关键。改善和提高训练过程中运动员的心脏功能是运动医学专家关注的焦点。最近十年来，运动基因组学发现，运动能力及运动的健康效应与个体遗传基因存在着密切关系。但是，个体遗传基因的差异仅仅可以解释个体耐力训练、最大耗氧量、力量以及其它关键性状50%的差异［4］。近年，随着表观遗传学的不断发展及其对运动医学领域的交叉渗透，国内外学者开始尝试从控制基因转录表达的表观遗传方面，如微小RNA、DNA甲基化和乙酰化，来研究运动导致心脏血流动力负荷增加所引起的心脏结构和功能的改变，从而帮助运动员更好的适应训练方式，改善和提高心脏功能［9］。

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类大约22个核苷酸组成的的单链非编码RNAs，其通过与基因3’非编码区域结合，在转录后水平发挥着基因调节的作用［1］。miRNAs参与了细胞周期调控、细胞分化、发育、代谢和凋亡等一系列生理和病理进程［2］，近年来，对于miRNAs已经成为热点研究。有研究发现，miRNAs在心脏的生长和发育过程中存在着差异表达的情况，其通过对靶基因的调控影响心脏的重塑过程。miRNAs特异表达谱能够对扩张性心肌病、肥厚性心肌病、急性心肌梗塞等心脏疾病起到早期精确指示作用［7，13］。研究证实，心肌成纤维细胞产生大量胶原蛋白、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）会导致心脏病理性肥大，心室顺应性降低，影响心脏功能的发挥［16］。miRNA-1，133a和133b则可以抑制转录生长因子-β的表达，降低心肌成纤维细胞胶原蛋白的产生，从而对心脏结构和功能产生保护作用［18］。Soci和他的同事则发现，miRNA29c可以降低心肌组织中胶原蛋白基因的转录和翻译，从而提高心室顺应性［17］。Duisters则发现，在心肌疾病中miRNA-30c和miR-133显著下调，而CTGF、胶原蛋白和纤维化则显著增加，在随后的动物和细胞实验中证实miRNA-30c通过与CTGF基因mRNA3’非编码区结合，从而可以有效抑制CTGF蛋白的表达［8］。

运动可以使机体各组织和器官miRNA表达量产生变化，特异性表达的miRNA通过对靶基因的调控来影响机体对运动的适应［5］。本研究在前人研究的基础上猜测长期有规律的有氧运动可以使小鼠心肌组织产生特异表达的miRNA，它们通过影响CTGF的表达而影响小鼠心室顺应性。由此本研究首先通过基因芯片筛选出有氧运动组和对照组小鼠心脏差异性表达的miRNA，再用实时定量的PCR来验证几个关健的miRNA，最后通过miRNA与CTGF表达的相关分析，来重点探索心脏对运动适应的分子机制。

1 材料与方法

1.1 分组

实验用小鼠20只，均为6周龄的KM小鼠，平均体重为15.9±2.1g，由某大学医学院动物实验中心提供。实验动物购入后，首先在实验室动物房将小鼠分笼为3～4只／笼，然后对小鼠进行适应性喂养一周，饲料为标准普通饲料，控制动物房温度恒定为22℃，每天12h自然光照，小鼠能够自由饮食和饮水；在适应性喂养一周后，根据随机数字表将20只小鼠随机分为2组，每组10只；一组小鼠在原饲养条件下，不进行任何处理，为安静对照组，另一组小鼠在原饲养条件下，同时进行为期8周的有氧运动训练。在进行实验前对两组小鼠称量体重，发现两组间小鼠体重无统计学差异。

1.2 小鼠有氧运动训练方法

有氧运动训练组小鼠进行无负重游泳训练，小鼠游泳池为一长方体鱼缸改装而成，规格为100cm×80cm×50 cm，水深30cm，水温控制为22℃。在正式有氧运动训练前，首先让实验组小鼠在游泳池内进行为期3天，每天2次，每次10min的适应性游泳。然后实验组小鼠正式开始8周的有氧运动训练，每周训练5天。前5周，小鼠每天在早上时间7:30—8:30进行一次有氧游泳，后3周小鼠每天运动2次，期间间隔12h，运动时间固定在每天早上7:30—8:30和晚上19:30—20:30，运动持续时间由第一周的30min开始，每周增加10min直至90min。当在有氧游泳过程中发现小鼠动作不协调，有下沉趋势时，将其取出休息3min，待其体力恢复后，再放入游泳池中继续游泳。有氧运动训练结束后，分别对两组小鼠进行游泳最长耐力时间测定，记录每只小鼠游泳最长坚持时间。小鼠游泳运动结束后迅速吹干毛发，放回鼠笼中。

1.3 小鼠心脏超声心动图测定方法

小鼠有氧运动训练结束后一周，对全部小鼠进行心脏超声心动图检测，具体方法为:首先对小鼠腹腔注射25%乌拉坦（用量为1ml／100g）麻醉，随后将小鼠仰卧固定在35℃恒温加热板上，对小鼠左胸前进行脱毛处理，最后使用高分辨小动物超声成像系统（Vevo770型号，加拿大Visual Sonics公司）和连接15L8高频探头的超声仪（Contrast Pulse SequencingTM，Sequoia 512，德国Siemens公司）对小鼠心脏进行超声心动图检测。将高频探头频率设置为30MHz，聚焦深度为1.3cm，采集小鼠心脏二维、M型超声心动图像，测量评价小鼠心脏形态和功能学的各项指标。本次研究选用的形态学指标有舒张期心室后壁厚度（PWTD）、收缩期心室后壁厚度（PWTS）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、舒张期心室隔膜厚度（IVSTD）和收缩期心室隔膜厚度（IVSTS）；选用的功能学指标有左室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短指数（LVFS）、平均环周纤维缩短速率（VCF）、E波峰值（Peak E）、A 波峰值（Peak A）、E波峰值和A波峰值的比值（Ratio E／A）和左室等容舒张时间（IVRT）。

1.4 小鼠心脏组织取样和称重

在有氧运动最后一次训练结束48h后，首先将所有小鼠称重（BW），随后迅速将小鼠颈椎脱位法猝死，然后解剖小鼠将心脏完整取出并进行修剪，将心脏沿冠状面切开，用滤纸吸干心脏表面液体后称重心脏（HW），最后将小鼠心脏组织迅速放入液氮中速冻后，再转至-80℃超低温冰箱中保存待用。

1.5 miRNA芯片和实时定量PCR技术检测miRNA方法

1.5.1 小鼠左心室组织总RNA提取和质量检测

用液氮预冷自动组织研磨仪的切头后对小鼠左心室组织样本进行研磨，严格按照TRIzol试剂（Invitrogen公司）说明书的步骤，逐步提取出组织样本中的总RNA。应用紫外分光光度计测定总RNA的吸光度A260值和A280值，用A260值计算总RNA浓度，计算A260／A280值检测提取的总RNA的纯度；最后用琼脂糖凝胶电泳进一步检测RNA质量。

1.5.2 miRNA芯片检测不同组别小鼠左心室组织miRNA的表达

分别将有氧运动训练组和对照组小鼠左心室组织提取的总RNA混合在一起，使用LNATMmiRNA 芯片（11.0版，丹麦Exiqon公司）检测两组样品miRNA的表达水平。LNATMmiRNA芯片中包含了1807个特异性探针，可以检测Sanger miRBase 11.0数据库中小鼠全部609条miRNA。分别取5μg上述两组左心室组织样本的总RNA进行miRNA芯片杂交，具体步骤按照各试剂说明书进行；杂交后芯片用生物芯片扫描仪（Genepix 4000B，美国 Molecular Devices公司）635nm波长进行图像扫描，所得数据用生物芯片扫描分析软件（Genepix Pro 6.0，美国 Molecular Devices公司）分析，使用原始值减去背景值做修正，并用中值进行标准化，分别计算出两组样本之间标准值的比值。

1.5.3 实时定量PCR检测候选miRNA的表达量

取每个样本左心室组织总RNA 2μg作为初始模板，按照说明书配制总反应体系20μl，应用第一链cDNA合成试剂盒（中国上海，上海研拓生物科技有限公司）在核酸扩增仪（Gene Amp PCR System 9700，美国ABI公司）进行逆转录合成cDNA。随后去掉上述合成的cDNA为模板，以U6作为内参，每个检测样本做3个复孔，在实时荧光定量PCR系统（7900HT Fast，美国 ABI公司）进行实时定量PCR，具体步骤严格按照说明书进行。实验中所用引物均由美国ABI公司合成。根据系统收集的数据采用2-ΔΔCT法计算样品中miRNA的相对含量，其中CT值为PCR反应检测到的荧光强度值显著大于背景值的循环数，计算公式为ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参；ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组。

1.6 小鼠左心室组织CTGF基因和蛋白表达测定

将上述各样本抽提的总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录生成单链cDNA，最后用定荧光量PCR试剂盒（DyNAmo SYBR Green qPCR，上海博华生物科技有限公司）检测CTGF基因的mRNA表达水平，各操作步骤均依照试剂盒说明书进行。以β-actin基因表达量作为定量PCR的内参。基因表达变化倍数采用以下公式计算:ΔCt＝Ct目的基因-Ct内参；ΔΔCt＝ΔCt实验组-ΔCt对照组。将上述各样本左心室组织研磨液沉淀离心后，取10μl组织液，用小鼠结缔组织生长因子酶联免疫分析试剂盒（美国R＆D公司）进行蛋白含量的测定，具体步骤按照试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法

资料采用SPSS 15统计软件分析，定量资料以均数±标准差（）表示，所有定量资料均进行正态性检验，因本文所有资料均服从正态性假设，故当方差齐性时，两组定量资料间的比较采用t检验，当方差不齐时，两组定量资料的组间比较采用t’检验，两变量的相关性分析采用Pearson相关分析法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有氧运动训练后小鼠与对照组一般特征比较

为了评价小鼠8周有氧运动训练后的效果，本研究检测了有氧运动训练组与对照组小鼠身体一般形态学指标以及血液动力学指标。结果发现，8周后有氧运动训练组小鼠体重（23.76±2.67）与对照组（23.33±2.56）相比差异无统计学意义（P＝0.718）；有氧运动训练组小鼠血压（112±6）与对照组（107±5）相比差异同样无统计学意义（P＝0.058）；有氧运动训练组小鼠 HR（310±10次／min）显著低于对照组（346±13次／min，P＜0.001）；有氧运动训练组小鼠 HW（mg），HW／BW（mg／g）、˙VO2max（ml／kg／min）和运动耐受时间均高于对照组，其中与对照组相比有氧运动训练组小鼠 HW增加了18.1%，HW／BW增加了15.8%，˙VO2max增 加 了 19.6%，运 动 耐 受 时 间 增 加 了31.6%，两组间这些指标经统计学检验，差异均具有统计学意义（P＜0.001）。由此证明，8周有氧运动训练对小鼠的形态学和血流动力学指标产生了影响，如小鼠心脏重量增加，静息状态下心动降缓、摄氧量增加、运动耐受时间增长等。

2.2 有氧运动训练组与对照组小鼠超声心动图结果比较

8周有氧运动训练后，同时对两组小鼠心脏进行超声心动图检测，发现有氧运动训练对小鼠心脏结构和功能均有明显影响。有氧运动组小鼠收缩期心室后壁厚度（PWTS）、左心室舒张末期内径（LVEDD）、舒张期心室隔膜厚度（IVSTD）和收缩期心室隔膜厚度（IVSTS）4个心脏形态学指标均显著高于对照组，差异有统计学意义（P均＜0.05）；两组间舒张期心室后壁厚度（PWTD）差异无统计学意义（P＝0.487）；有氧运动组小鼠左室等容舒张时间（IVRT）显著低于对照组小鼠，差异有统计学意义（P＝0.002）；有氧运动组小鼠E波峰值和A波峰值的比值（Ratio E／A）显著高于对照组小鼠，差异有统计学意义（P均＜0.001）；两组间左室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短指数（LVFS）和平均环周纤维缩短速率（VCF）差异无统计学意义（P均＞0.05）。总体结果表明，8周有氧运动训练后小鼠心脏呈现生理性肥大变化，同时其心脏顺应性也有一定程度提升（表2）。

表1 本研究有氧运动训练组与对照组小鼠一般特征比较一览表Table 1.General characteristics between aerobic exercise training mice and control mice

表2 本研究有氧运动训练组与对照组小鼠超声心动图检测结果比较一览表Table 2.Echocardiography Measurements between Aerobic Exercise Training Mice and Control Mice

2.3 有氧运动训练后小鼠左心室肌组织miRNA表达结果

在有氧运动引起的小鼠心脏生理性肥大中，为了检测出差异表达的miRNA，本研究采用基因芯片检测609个小鼠miRNA，miRNA检测相对量在两组间相比倍数大于2，即认为两组间该miRNA表达有差异。结果发现，与对照组左心室肌组织相比，有氧运动训练后小鼠左心室肌组织中表达上调超过2倍的miRNA有12个，分别为hsa-miR-29c、hsa-miR-30c、hsa-miR-181b、hsa-miR-363、hsa-miR-181c、hsa-miR-338-3p、hsa-miR-1225-5p、hsa-miR-26b、hsa-miR-132、hsa-miR-15a、hsa-miR-939 和 hsa-miR-7；表达下调超过2倍的miRNA有8个，分别为hsa-miR-1、hsamiR-133a、hsa-miR-16、hsa-miR-21、hsa-miR-125b、hsamiR-145、hsa-miR-126和hsa-miR-652（表3）。参考相关文献，同时选取上调倍数和下调倍数处于前两位的miRNA，分 别 为 hsa-miR-29c、hsa-miR-30c，hsa-miR-1 和 hsa-miR-133a，使用实时定量PCR检测来验证其差异表达是否与基因芯片结果一致。结果发现，此四个miRNA定量PCR检测结果与基因芯片检测结果趋势一致，有氧运动组小鼠左心室肌组织miRNA-1和miRNA-133a显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；有氧运动组小鼠左心室肌组织miRNA-29c和miRNA-30c显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

表3 本研究有氧运动训练后小鼠心室肌细胞miRNA差异表达结果一览表Table 3.Differential Expression of miRNAs in Left Ventricle Induced by Aerobic Exercise Training

图1 本研究有氧运动训练组和对照组小鼠心室肌细胞miRNA-1、miRNA-133a、miRNA-29c和miRNA-30c实时定量PCR表达结果Figure 1.Differential Expression of miRNAs-1，133a，29c and 30cin Left Ventricle by Real-time PCR in Aerobic Exercise Training Mice and Control Mice

2.4 有氧运动训练组与对照组小鼠左心室组织CTGF基因和蛋白表达结果以及有氧运动训练组小鼠心肌CTGF蛋白与miRNA-30c的相关分析

在有氧运动引起的小鼠心脏生理性肥大中，为了研究结缔组织生长因子（CTGF）的作用，本研究在两组小鼠中检测了左心室CTGF基因和蛋白的表达量，结果发现，有氧运动训练组小鼠左心室CTGF基因和蛋白的表达量均显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，图2）。同时相关分析发现，在有氧运动训练组小鼠左心室组织中CTGF蛋白表达量与miRNA-30c表达量呈显著负相关（P＝0.004），相关系数r为-0.818（图3）。

图2 本研究有氧运动训练组和对照组小鼠左心室肌组织CTGF基因和蛋白表达结果Figure 2.Gene and Protein Expression of CTGF in Left Ventricle of Aerobic Exercise Training Mice and Control mice

图3 有氧运动训练组小鼠左心室肌组织CTGF蛋白和miRNA-30c的相关分析Figure 3.Correlation Analysis of CTGF Protein and miRNA-30cin Left Ventricle of Aerobic Exercise Training Mice

3 讨论与分析

本研究探讨了有氧运动训练对小鼠心脏形态结构、功能及心室肌miRNAs的影响，结果发现，有氧运动训练明显提高了小鼠心室内径、心壁厚度和功能学指标Ratio E／A，提示运动诱导小鼠心脏生理性肥大，增加了心室顺应性；与安静对照组相比，8周有氧运动训练后小鼠心肌组织中miRNA-1和-133a显著下降，而miRNA-29和-30c则显著升高；同时观察到有氧运动训练组小鼠心肌组织中CTGF基因和蛋白的表达显著低于对照组；进一步研究发现，有氧运动训练组小鼠心肌组织中miRNA-30c表达量与CTGF蛋白表达量呈负相关，相关系数r＝-0.818。由此可知，有氧运动训练通过增加心室肌组织中miRNA-30c的表达量，抑制心肌组织中CTGF的表达和浓度，从而提高了运动引起心脏生理性肥大过程中心室顺应性，有利于心脏功能的正常有效发挥。

近年，随着表观遗传学的不断发展及其对运动医学领域的交叉渗透，国内、外学者开始尝试从控制基因转录表达的表观遗传方面，如微小RNA（micro RNA）、DNA甲基化和乙酰化，来研究运动导致心脏血流动力负荷增加所引起的心脏结构和功能的改变，改善和提高运动员心脏功能，帮助运动员更好的适应训练方式以及取得优异的成绩。微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一类大约22个核苷酸组成的单链非编码RNAs。miRNAs的生成非常复杂，需要许多酶蛋白以及RNAs的参与。首先，细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录出的长链初始RNAs被RNA酶Ⅲ家族的Drosha和DGCR8组成的酶复合体剪切成长约65-70核苷酸、带有茎环结构的前体miRNAs；随后，前体miRNAs被转运至胞浆，在同样RNA酶Ⅲ家族Dicer酶的处理下形成长度约22个核苷酸的双链miRNAs，其中一条链很快降解，另一条链进入RNA诱导沉默复合体成为成熟的miRNAs。与RNA诱导沉默复合体结合的miRNAs，通过碱基配对方式结合到靶基因mRNA的3’端非翻译区，诱导靶mRNA的降解或抑制其翻译成蛋白质，在转录后水平发挥着基因调节的作用［12］。miRNAs参与了细胞周期调控、细胞分化、发育、代谢和凋亡等一系列生理和病理进程。研究发现，miRNAs在心脏的生长和发育过程中存在着差异表达的情况，其通过对靶基因的调控影响心脏的重塑过程。

有研究已经证实，miRNA-1、-133a和29c对于心脏生理性或病理性肥大中心肌组织重塑和功能发挥起着非常重要的作用。miRNA-1和-133a在正常心肌组织呈高表达状态，而在肥厚性心肌病和心房扩张病人心脏中表达水平则显著降低［19，20］。Ikeda在体外心肌细胞中发现，miRNA-1通过与钙调蛋白、Mef2a和Gata4等心肌肥大相关基因3’端非编码区结合抑制心肌组织这些基因的表达水平，在裸鼠和成年小鼠心肌细胞培养中增加miRNA-1水平，可明显抑制心肌细胞肥大［11］。Liu通过基因工程技术敲除小鼠miRNA-133a和-133b基因后发现，小鼠心脏纤维化导致心脏严重畸形，如室间隔缺损、右心房和心室扩大［14］。本研究通过8周有氧运动训练诱导了小鼠心脏肥大，同时发现其心脏组织中miRNA-1和-133a显著下降，这可能是运动抑制了相关miRNA表达，从而使原来被抑制的心肌肥大相关基因被激活，使心脏纤维化增加导致心脏生理性肥大。Castoldi和他的同事报道，心肌组织中miRNA-133a和29c可以抑制Ⅰ型胶原蛋白的表达，miRNA-133a和29c表达量下降，介导了血管紧张素Ⅱ依赖性高血压心肌纤维化的发生［6］。Van等在小鼠和人体心脏组织中研究发现，miRNA-29可以调节多种胶原蛋白、纤维蛋白的表达，其表达下降会增加胶原蛋白和纤维蛋白的表达，从而导致心脏纤维化［21］。运动对心肌组织中miRNAs的表达影响的研究很少，国内学者赵永才研究运动对小鼠心肌miRNAs的影响时发现，运动降低了心肌组织中miRNA-1和133a的表达，miRNA-1和133a表达下降与运动致心脏生理性肥大过程中心脏重塑有关［3］。Soci则发现，有氧运动降低了小鼠心肌组织中miRNA-1和133a的表达同时，增加了miRNA-29c的表达，同时证实miRNA-29c表达增加提升了小鼠心室顺应性［17］。本研究发现，有氧运动训练后小鼠心肌组织中miRNA-29c显著升高，这与Soci的研究是一致的，这可能是运动诱导了miRNA-29c的表达，miRNA-29c的表达的增加可以抑制心脏胶原蛋白和纤维蛋白的表达，从而调节由于运动致心脏miRNA-1和133a表达量降低，而导致的心脏过度纤维化，避免了运动致心脏生理性肥大过向病理性纤维化转化，提升了心脏心室顺应性，有利于心脏对运动的生理性适应。

心脏组织中细胞外基质在保持心脏收缩力量和心肌细胞间电信号的传递方面发挥重要的作用，但是，在高血压和压力负荷等病理反应刺激下，心脏组织中细胞外基质蛋白质过度积聚在心脏中，会改变心脏收缩力量和肌电信号传递，从而对心脏功能的发挥产生不利影响［15］。结缔组织生长因子（CTGF）能够诱导心肌细胞外基质蛋白质的合成，介导心肌组织纤维化［10］。Rudy和他的同事观察到，在有心脏疾病的裸鼠以及左心室肥大的病人中miRNA-30表达量与CTGF水平显著负相关，同时发现在体外培养的心肌细胞和成纤维细胞中敲除miRNA-30基因，则会增加CTGF的表达水平。进一步研究发现，miRNA-30可以与CTGF基因3’端结合，从而抑制CTGF的表达［8］。在本研究中发现，有氧运动诱导小鼠心肌组织中miRNA-30c的表达，同时发现有氧运动组小鼠心肌组织中CTGF表达水平与miRNA-30c量显著负相关，这与前人研究是一致的；同时本研究也观察到，有氧运动后小鼠心室顺应性增加了，这可能与有氧运动诱导miRNA-30c表达，miRNA-30与CTGF基因3’端结合从而抑制CTGF的表达，同时CTGF表达的降低下调了心肌组织中细胞外基质蛋白的水平，避免了运动诱导心脏生理性肥大过程中心肌组织过度纤维化，从而有利于心脏生理性肥大过程中心脏功能的正常发挥。

4 总结

本研究发现，有氧运动训练诱导了心室肌组织中miRNA-30c的表达，抑制了心肌组织中CTGF基因的表达和蛋白浓度，提高运动引起心脏生理性肥大过程中心室顺应性，有利于心脏功能的正常有效发挥，为避免运动员在高强度训练过程中心脏负荷过大而造成心脏损害，提供了新的思路和方向。

今后需要研究更多心脏相关miRNAs，探讨在不同运动条件下，它们对心脏影响的更深层次的分子生物学机制，同时，将研究结果在大样本人群中进行验证。

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