模拟高原训练对大鼠心肌线粒体的影响及小麦肽的干预作用

金其贯，金爱娜，潘兴昌，汪 飞，刘 霞，蔡木易

在高原训练过程中，机体承受高原缺氧和运动双重刺激，从而产生强烈的应激反应，以调动体内的机能潜力，产生一系列有利提高运动能力的抗缺氧生理反应。心肌组织中含有丰富的线粒体，是机体摄氧量高而又对缺氧十分敏感的组织之一。有研究表明，在高原训练时，机体产生大量氧自由基，易引起组织的氧化损伤［26，27，30］，而 线 粒 体不仅是产生内源性自由基的主要场所，也是自由基攻击的靶部位［28］。线粒体结构和功能的损伤就会影响心肌的能量代谢，从而降低心脏的功能，影响高原训练的效果。因此，在高原训练中如何采取有效的措施减少心肌线粒体的氧化损伤对提高高原训练的效果具有非常重要的作用。小麦肽是以小麦蛋白为原料经过特定的微生物进行发酵或特定的蛋白酶进行水解，分离制得具有多种生物活性的活性肽，具有抗氧化、调节机体免疫力、改善脂质代谢、抗肥胖、抑制胆固醇等作用［3，4，13，21，32］。但是，小麦肽对高原训练机体心肌线粒体结构和功能的干预作用目前尚未见到研究报道。本研究通过交互设计的研究方案，对大鼠进行9周的模拟低氧和／或运动训练，并在高原训练过程中补充小麦肽，观察大鼠心肌线粒体的超微结构、ATP酶（ATPase）的活性、细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase，CCO）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性，分别探讨高原训练中低氧和运动训练两个因素对心肌线粒体结构、功能的影响机制及其小麦肽的干预作用，为小麦肽在高原训练中的具体应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象与分组

选用清洁级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，6周龄，体重160～180g，购于浙江省实验动物中心［许可证号SCXK（浙）20080033，质量合格证号0016507）］。随机分成常氧对照组（C，n＝10）、运动训练组（E，n＝10）、低氧对照组（HC，n＝10）、低氧＋运动训练组（HE，n＝10）和低氧＋运动训练＋小麦肽组（HEW，n＝10）5组。分笼饲养，每笼5只，饲养温度20±2℃，自然光照，每天更换一次垫料，保持笼内干燥。

1.2 实验方案

运动组（E、HE、HEW）大鼠在每天下午进行无负重游泳运动，每周运动6天。运动训练时间为9周，前2周进行适应性运动，并在2周之内运动时间过渡到90min；游泳池为100cm×70cm×60cm长方体游泳桶，水深50cm以上、水温32±1℃。运动时注意观察大鼠状态，防止溺水死亡，及时捞出大鼠粪便，保持泳池清洁。在训练过程中E组有2只大鼠意外溺亡。HC、HE和HEW组在实验期间均在低氧舱中生活和训练，在2周内逐渐提高到3000m海拔高度，氧浓度为14.2%，低氧舱为美国 Higher peak公司生产的The MAG-10Mountain Air Generator。在每次训练后HEW组大鼠灌服小麦肽溶液，补充量为500 mg／kg·bw，小麦肽由中国食品发酵工业研究院（北京中食海氏生物技术有限公司）提供。

1.3 实验取材和样本处理

末次运动训练后，禁食12h。在第二天早晨依次称重，按50mg／kg的剂量腹腔注射2%的戊巴比妥钠溶液进行麻醉，从腹主动脉取血。然后在心尖部切取心肌组织，迅速切取一块米粒大小的组织块，置于5%的戊二醛溶液中固定，以备制作电镜切片，其余迅速置液氮中保存。从液氮内取出心肌组织，准确称重400mg，剪碎，移入玻璃匀浆器，然后加入9倍重量的预冷生理盐水，在冰浴中仔细研磨，制备浓度约为10%的心肌组织匀浆。用普通低速离心机1500rpm，4℃离心10min，取上清以高速离心机10000rpm离心15min，弃上清后，加生理盐水制备成线粒体的混悬液，利用somiprep150型超声发生器超声破碎心肌线粒体，以备测定心肌线粒体内的CCO、MDA含量及SOD、ATPase活性。心肌线粒体的提取方法参照南京建成生物工程研究所提供的实验方法。

1.4 指标测定

从戊二醛中取出心肌组织，常规包埋、制片，用Tecnai 12型透射电镜观察心肌和线粒体的超微结构，摄片并存档。ATPase、SOD活力、MDA含量和蛋白定量分别采用比色法、黄嘌呤氧化酶法、TBA法和考马斯亮兰法测定，试剂盒均购于南京建成生物研究所，测试仪器为722型紫外分光光度计。CCO含量的测定采用酶联免疫法检测，试剂盒购于上海朗顿生物科技有限公司，测试仪器为ELX800型酶标仪。

1.5 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件处理数据，结果用均数±标准差（）表示，统计学分析采用双因素方差分析和独立样本t检验，P＜0.05表示为显著性差异，P＜0.01表示为极显著性差异。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌及线粒体超微结构的变化

如图1所示，C组心肌肌原纤维走形规则，Z线清晰，排列整齐。线粒体内外膜完整，大小基本一致，嵴清晰可见。E组心肌肌原纤维走形规则，Z线清晰，排列基本整齐。线粒体大小基本一致，内外膜完整，嵴清晰。但有少量线粒体出现皱缩，嵴模糊不清。HC组心肌肌原纤维排列不齐，Z线紊乱，部分肌丝模糊。线粒体大小不一，部分线粒体出现皱缩，内部结构模糊不清，也有部分线粒体肿胀，嵴出现断裂或溶解。HE组心肌肌原纤维排列不整齐，Z线模糊、紊乱或消失，部分肌丝出现断裂，溶解，线粒体排列混乱，部分线粒体肿胀，嵴减少，内部结构模糊不清。HEW组心肌肌原纤维排列有轻度扭曲，Z线清晰，线粒体体积大小不一，数量增多，在细胞核附近线粒体成族聚集，部分线粒体挤压变形，部分线粒体内部结构模糊不清。

2.2 心肌线粒体ATPase活性和CCO含量的变化

C、E、HC和HE进行双因素分析后可知，长期的运动训练可使大鼠心肌线粒体ATPase活性显著下降，CCO含量虽有所降低，但无显著性差异（P＞0.05）。低氧暴露可使大鼠心肌线粒体ATPas活性和CCO含量均显著降低；低氧和运动训练对进一步降低ATPase活性具有显著的交互作用，但对进一步降低CCO含量无显著的交互作用。与HE组相比，HEW组心肌线粒体ATPase活性和CCO含量均显著增加（表1）。

表1 本研究各组大鼠心肌线粒体ATPase活性和CCO含量的变化一览表Table 1 The Changes of Myocardial Mitochondrial ATPase Activity and CCO Content in Different Groups of Rats

2.3 心肌线粒体脂质过氧化水平的变化

图1 本研究各组大鼠心肌超微结构的变化Figure 1.The Changes of Myocardial Ultrastructure in Each Group of Rats

C、E、HC和HE进行双因素分析后可知，长期的运动训练可使大鼠心肌线粒体MDA含量显著增加，SOD活性有所降低，但无显著性差异；低氧暴露可使大鼠心肌线粒体MDA含量显著增加，SOD活性显著降低；低氧和运动训练对进一步升高MDA含量具有显著的交互作用，但对进一步降低SOD活性无显著的交互作用。与HE组相比，HEW组心肌线粒体MDA含量显著降低，SOD活性有所升高，但无显著性差异（表2）。

表2 本研究各组大鼠心肌线粒体MDA含量和SOD活性的变化一览表Table 2 The Changes of Myocardial Mitochondrial MDA Contents and SOD Activity in Different Groups of Rats

3 分析与讨论

线粒体作为细胞呼吸和氧化磷酸化的重要场所，在维持心肌细胞正常的能量代谢方面具有重要作用。线粒体中含有丰富的ATPase和CCO，其中CCO是电子传递链的最后一个关键载体。作为线粒体内膜上呼吸链和氧化磷酸化系统的关键酶，其含量的多少和活性的高低直接影响着呼吸链电子传递过程的效率，影响机体的能量产生［5］。因此，ATPase和CCO活性的高低可以反映线粒体的功能。研究发现，线粒体对缺氧非常敏感，急性缺氧不仅可以导致心肌线粒体结构和功能的破坏，且随着氧含量的降低，其损伤程度加重［14，22］；而慢性缺氧可引起线粒体的结构和功 能 出 现 代 偿 或 部 分 代 偿［14，16，29，31］。 但 有 研 究 发 现 ，2 周的间歇性缺氧（吸入15%低氧混合气）可使小鼠心肌SDH、ATP酶减少，LDH升高，心肌间质水肿，心肌细胞线粒体肿胀，肌丝排列紊乱［19］。运动训练对心肌线粒体的结构和功能也会产生双向效应。长时间有氧运动训练可以增加老年大鼠心肌线粒体含量，提高线粒体呼吸链复合酶（包括CCO）活性，延缓衰老过程中线粒体功能的退行性变化［9］，并能有效地防止低氧-复氧所引起的线粒体损伤，维持心肌线粒体的功能［25］。但是，大负荷的运动训练可导致心肌线粒体的结构发生损伤［17］，而且可以导致心肌线粒体中ATP、能荷以及NADH、CCO都显著下降［15］。

近年来，低氧复合运动对心肌线粒体的作用逐步受到人们的关注，但由于低氧的程度、训练模式、运动强度及其持续时间的不同，心肌线粒体结构和功能的变化也不一致，且大多数研究集中在间歇性低氧模式上。急性低氧运动不仅可造成小鼠心肌闰盘和线粒体超微结构损伤，还使心肌线粒体Na＋-K＋和Ca2＋-ATPase活性降低，能量代谢受到障碍，但是，经过4周的间歇性低氧训练后，3000m组心肌闰盘和线粒体的结构基本恢复，心肌线粒体Na＋-K＋和Ca2＋-ATPase活性升高，而4000m组心肌闰盘和线粒体的结构未能恢复，心肌线粒体Na＋-K＋和Ca2＋-ATPase活性显著低于3000m组［12］。黄丽英［6］研究发现，模拟海拔3000m急性低氧可使大鼠心肌的超微结构发生损伤，如果在1h的急性运动后再进行3000m的低氧应激可使心肌损伤程度进一步加重，表现为心肌闰盘电子密度增高，部分断裂；在心肌闰盘附近的肌原纤维排列严重紊乱，线粒体肿胀，嵴断裂，脱基质；海拔4000m急性低氧运动组心肌闰盘和线粒体的损伤更为严重。经过慢性间歇性低氧（12h／d）和运动训练4周后，3000m组大鼠心肌线粒体损伤基本恢复，而4000m组大鼠心肌线粒体的损伤仍未恢复到常氧组水平，但与急性组比较，损伤程度已明显减轻。与此同时，急性低氧可使大鼠心肌线粒体中游离Ca2＋浓度、ATP 含量和 ATPase活性下降，4周3000m间歇低氧适应后，上述指标有上升趋势，与运动训练相结合其上升趋势更为明显，而4000m组则呈下降趋势。间歇性低氧训练不仅可减轻大鼠心肌线粒体的损伤，而且，可显著增加心肌有氧代谢酶（ATPase、CCO）活性，改善心肌线粒体Ⅲ态呼吸（ST3），线粒体氧化磷酸化功能维持相对恒定［1，20，23］。但是，李爱红［10］研究表明，4周的高住低练可使大鼠心肌线粒体数量增多，整齐地沿着肌纤维方向排列，嵴清晰可见；而低住高练、高住高练和高住高练低训均使心肌线粒体形态结构发生不同程度的损伤，表现为线粒体肿胀，嵴聚集，数量减少。而长期的高原训练影响心肌线粒体结构和功能的研究报道较少。本研究在模拟海拔3000m高度的低氧舱中进行90min的有氧运动训练9周，并与常氧对照组（C）、常氧训练组（E）和低氧对照组（HC）相比较，结果发现，与C组相比，E组大鼠心肌肌原纤维走形规则，Z线清晰，排列基本整齐。线粒体大小基本一致，内外膜完整，嵴清晰。但有少量线粒体出现皱缩，嵴模糊不清。HC组心肌肌原纤维排列不齐，Z线紊乱，部分肌丝模糊。线粒体大小不一，部分线粒体出现皱缩，内部结构模糊不清，也有部分线粒体肿胀，嵴出现断裂或溶解。HE组心肌肌原纤维排列不整齐，Z线模糊、紊乱或消失，部分肌丝出现断裂，溶解，线粒体排列混乱，部分线粒体肿胀，嵴减少，内部结构模糊不清。C、E、HC和 HE进行双因素分析后可知，长期的运动训练可使大鼠心肌线粒体ATPase活性显著下降，CCO含量虽有所降低，但无显著性差异（P＞0.05）。低氧暴露可使大鼠心肌线粒体ATPas活性和CCO含量均显著降低；低氧和运动训练对进一步降低ATPase活性具有显著的交互作用，但对进一步降低CCO含量无显著的交互作用。从而说明，长期的耐力性运动训练可以引起心肌线粒体的形态结构和功能发生轻微的损伤，低氧暴露可引起心肌线粒体的结构和功能发生明显的损伤，而高原训练引起的心肌线粒体结构和功能的损伤程度比单纯低氧更加严重。本结果与上述部分研究结果不一致，其原因可能是由于本实验采用模拟传统高原训练的模式，且训练周期相对较长。在长期的持续性低氧环境中进行大负荷的运动训练，机体承受高原缺氧和运动缺氧的双重刺激，使心肌线粒体缺氧加重，从而引起结构和功能损伤。因此，适度的低氧和运动训练可使心肌线粒体结构和功能产生一定程度的适应，提高心脏的功能；如果低氧和训练强度超过一定限度则会对线粒体的结构和功能造成一定的损害，甚至是不可逆的损伤。在高原训练或低氧训练中，需要把低氧的程度、持续时间的长短和运动训练负荷合理地组合，来达到运动与低氧适应，提高训练效果。

有研究发现，低氧和运动时心肌线粒体结构和功能的变化与脂质过氧化水平有关［26，28］。线粒体受到自由基攻击后膜流动性降低，线粒体膜磷脂降解，影响CCO及ATPase的活性［8，18］。有研究表明，高原低氧环境中机体内MDA含量明显高于平原，且随海拔高度的升高而增高，随高原居住时间的延长而降低；而高原地区正常人SOD活性明显低于平原地区，且随海拔升高，SOD的活性逐渐降低［2］。长期适量的有氧运动训练可以降低心肌组织 MDA生成，提高SOD活性，而长时间大负荷的运动训练可使心肌组织SOD活性降低，MDA含量增加，引起心肌线粒体的损伤［7］。高原训练对心肌线粒体脂质过氧化水平的影响目前研究结果也不一致。4～5周的高住低训或高住高练低训可有效提高力竭性运动后心肌线粒体的抗氧化能力，维持线粒体呼吸链的功能［11，24］。有研究认为，高原训练能显著增加机体的氧化应激，损伤能量代谢和细胞膜的完整性［26］。为了研究长期的高原训练对心肌线粒体形态结构和功能的影响机制，本研究在观察心肌线粒体超微结构的同时，测定了心肌线粒体中SOD活性和MDA含量。通过双因素方差分析发现，长期的运动训练可使大鼠心肌线粒体MDA含量显著增加，SOD活性有所降低，但无显著性差异；低氧暴露可使大鼠心肌线粒体MDA含量显著增加，SOD活性显著降低；低氧和运动训练对进一步升高MDA含量具有显著的交互作用，但对进一步降低SOD活性无显著的交互作用。从而说明在低氧状态下进行运动训练（高原训练）可造成心肌线粒体脂质过氧化水平显著增加，从而造成心肌线粒体形态结构的破坏，最终导致心肌线粒体内ATPase活性和CCO含量显著降低，影响能量代谢功能，其损伤程度比常氧训练和低氧暴露更为严重。因此，在高原训练过程采取积极有效的措施来干预高原训练引起的氧自由基的生成，维持心肌线粒体的正常结构和功能，对提高高原训练的效果具有非常重要的意义。

研究表明，小麦肽有很强的抗氧化性，能显著提高机体 SOD 活 性 ，降 低 MDA 含 量［3，4，13，21，32］。 然 而，小 麦 肽 对高原训练机体心肌线粒体结构和功能的干预作用尚未见到研究报道。为了研究小麦肽的补充对长期高原训练大鼠心肌线粒体结构和功能的干预作用，本研究让大鼠在模拟3000m高度的低氧舱中进行运动训练9周，每天定时补充小麦肽，观察了大鼠心肌线粒体的超微结构以及ATPase活性和CCO含量。结果发现，与HE组相比，HEW组心肌肌原纤维排列有轻度扭曲，Z线清晰，线粒体体积大小不一，数量增多，在细胞核附近线粒体成族聚集，部分线粒体挤压变形，部分线粒体内部结构模糊不清。与此同时，HEW组心肌线粒体ATPase活性和CCO含量均显著增加。从而说明高原训练时补充小麦肽对减轻心肌线粒体结构和功能的损伤具有非常重要的作用。与此同时，与HE组相比，HEW组心肌线粒体MDA含量显著降低，SOD活性有所升高，但无显著性差异。从而说明小麦肽的补充能够显著抑制高原训练大鼠心肌线粒体氧自由基的生成，避免心肌线粒体产生过氧化损伤，对减轻高原训练大鼠心肌线粒体的损伤，维持线粒体的正常形态结构和功能有非常重要的作用。

4 结论

1.长期的高原训练能引起心肌线粒体抗氧化能力下降，氧自由基生成增多，心肌线粒体结构和功能发生病理性损伤。但在低氧和运动训练两个因素中，低氧对心肌线粒体结构和功能的影响占有主导地位。

2.补充小麦肽可提高高原训练大鼠心肌线粒体抗氧化能力，减少氧自由基的生成，对减轻高原训练大鼠心肌线粒体的损伤，维持线粒体的正常形态结构和功能有非常重要的作用。

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