Oct-4和Nestin在肺癌中共表达的临床意义

林育红 张丽丽▲ 刘彩刚

1.沈阳军区总医院呼吸内科，辽宁沈阳 110016；2.中国医科大学附属第一医院肿瘤外科，辽宁沈阳 110001

肺癌是最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤死亡率中位居前列。近年来，有包括手术、化疗、放疗等多种治疗策略被广泛应用于临床的肺癌治疗中。然而，大于40%的患者在接受了抗肿瘤的综合治疗后出现了肿瘤复发。肿瘤复发患者中有相当一部分出现了其他器官的转移灶，并且预后不佳。因此，明确肿瘤的复发和转移机制，在治疗肺癌的过程中有着极为重要的意义。

近年来研究表明，肿瘤干细胞在细胞的恶变、肿瘤复发和转移、肿瘤对放化疗的抵抗中起着决定性的作用[1－2]。肿瘤干细胞有着自我更新和向其他多种类型肿瘤细胞分化的能力，并且有很高的致瘤性[3]。但是，至今尚不清楚干细胞相关的基因是否也在肺癌组织中表达，及这些基因是如何调控肺癌的发生和发展的。

Oct－4是一种转录蛋白，通常在干细胞中表达，是未分化的胚胎干细胞自我更新中的决定性调控因子[4－5]。笔者之前的研究表明，Nestin在肺癌中显著表达。最近，笔者又发现在肺癌干细胞中Oct－4和Nestin的表达明显高于其在其他肿瘤细胞中的表达水平。但是，对于Oct－4和Nestin的表达与肺癌临床特征之间的关系，以及Oct－4和Nestin在体内、体外实验中对肺癌干细胞成瘤性的作用机制，几乎是完全不明了的。

本实验在分析Oct－4和Nestin在肺癌干细胞成瘤作用中的角色基础上，检测干细胞相关基因的表达水平。而后，又检测了320例肺癌干细胞中Oct－4和Nestin的表达水平，并分析Oct－4和Nestin的表达与预后之间联系的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2003年1月～2006年12月于沈阳军区总医院被确诊为肺癌的患者320例，其中，年龄小于35岁者48例，54例为T1期，而有128例未发现淋巴结转移。将获得的肿瘤组织样本以免疫组织化学方法进行检测。在此基础之上，用PCR法分析其基因表达水平。入选标准：①经过手术治疗的患者；②切除肿块病理证实确为肺癌；③取出多于15个淋巴结送检病理；④病例资料完整。排除接受过辅助疗法的患者。

1.2 实验方法

1.2.1 集落形成实验 肺癌干细胞及非干细胞购自沈阳华鑫生物科技有限公司，其中，肺癌干细胞组作为实验组，而非干细胞组作为对照组。将细胞以2×104/mL密度培养于含有超短半桥粒（Corning，Acton，USA）的全 Mammo Cult培养基（STEM CELL Technologies，Vancouver，Canada）中 7 d。以盲法计数＜20 μm的细胞球数量。

1.2.2 PCR法使用TRIzol试剂盒（Invitrogen，Carlsbad，USA）从肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中提取全RNA，根据厂家使用说明以RNA裂解小量洗脱净化工具（Qiagen，Chatsworth，USA）提纯。每次PCR分析的单个基因的循环阈值（Ct）都按照GADPH管家基因的平均Ct进行标准化。不同细胞组间基因的表达差异由循环阈值的差值（ΔCt）决定。实验组和对照组中每个基因表达的折叠变化由2－ΔΔCt计算所得。差值＞2的单个基因被认为是存在表达差异的。

1.2.3 免疫组织化学法 用免疫组织化学法检测肺组织中Oct－4和Nestin的表达水平。固定320例肺癌组织，并制成4 μm的组织切片，以二甲苯脱蜡，梯度酒精逐渐水化，再以磷酸缓冲液（PBS）冲洗，分别用1∶100浓度的鼠抗人Oct－4抗体和兔抗人Nestin抗体37°C孵育 1 h，PBS液洗涤后，以最佳生物素化的二抗（Multilink Swine anti－goat/mouse/rabbit immunoglobulin，Dako，Carpinteria，USA）在 37 °C中孵育30 min。用HRP抗生物素蛋白生物素复合物在室温下 30～60 min（以 1∶1000 的浓度，Vector Laboratories，Burlingame，USA）检测结合生物素基化的抗体。组织片段的免疫印迹以DAB做显色处理，以吉尔苏木素复染并观察。来自于个体组织的3个片段全部以单抗体着色，依照盲法，每个片段随机选择10个结构域通过病理检测Oct－4和Nestin的表达。根据以下标准半定量检测Oct－4和Nestin的表达水平，0：代表＜1%的赘生细胞印迹阳性；1+：代表≥1%而＜10%的形态学上明确的赘生细胞印迹阳性；2+：代表≥10%的形态学上明确的赘生细胞印迹阳性。显色1+或者2+的单个样本认为该蛋白表达阳性。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，大量的连续数据以t检验分析；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验或精确概率分析；疾病特异性生存率以生存分析和时间等级检验分析；个体因素的影响情况以COX比例机遇模型以向前阶梯式选择的方式进行多元统计分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤干细胞与非肿瘤干细胞培养情况

取肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞在体外培养7 d，检测细胞的成球情况。研究发现，肿瘤干细胞能够形成20～100 μm的细胞球，并且可以在体外试验中继续传代（图1A－B），而非肿瘤干细胞则不能（图1C－D）。

2.2 肺癌中Oct-4和Nestin的表达

在肺癌干细胞和非肺癌干细胞之间，用PCR法检测干细胞相关基因表达的差异性。本研究发现，CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和 TGF基因在肺癌干细胞和非肺癌干细胞中均有显著的表达差异，其中，Oct－4和Nestin通常由干细胞表达。为了显示Oct－4和Nestin的表达特征，本研究采用320例肺癌样本以免疫组化法分析Oct－4和Nestin的表达水平（表1）。研究发现，128例（40.00%）的肺癌组织中抗Oct－4阳性，而62例（19.38%）的肺癌组织中抗Nestin阳性。值得注意的是，有42例（13.13%）癌症组织中抗 Oct－4 和抗 Nestin 同时阳性（图2）。 分析显示，Oct－4和Nestin的共表达与年龄、组织学类型、淋巴结转移明显相关（P ＜ 0.05）。多元统计分析提示，在肺癌人群中，Oct－4和Nestin的共表达与年龄、淋巴结转移独立相关（P＜0.05）。 见表2。

表1 患者一般临床资料（例）

2.3 Oct-4和Nestin的共表达与肺癌预后不良相关

在所有320例样本中，303例患者生存期超过7.5年，占94.67%。生存分析显示，有Oct－4阳性表达的肺癌患者比Oct－4阴性表达患者有较低的生存率（71.09%比91.67%，χ2=29.04，P=0.001，图3A）。相似的是，有 Nestin 阳性表达的肺癌患者也比Nestin阴性表达的患者有较低的生存率（64.52%比 87.98%，χ2=30.71，P=0.001，图3B）。此外，Oct－4和Nestin共表达与预后不良有着明显的相关性（57.14%比 87.41%，χ2=48.49，P=0.001，图3 C、表3）。 值得注意的是，15例中有13例年龄＜35岁的Oct－4和Nestin表达阳性患者在术后5年内死亡。

表2 Oct-4和Nestin共表达的多元统计分析

表3 肺癌预后因子的多因素回归分析

3 讨论

研究已经证明，从实体瘤中分离得到的肿瘤干细胞有着高度的自我更新和分化成不同表现型的肿瘤细胞的能力。研究中发现，在肿瘤干细胞中有Oct－4和Nestin表达。此外，肿瘤干细胞，尤其是有Oct－4和Nestin高水平表达的肿瘤干细胞有成球能力，但是非肿瘤干细胞在同样的细胞培养条件下没有成球能力。这些异常的数据明确提示，肿瘤干细胞有着干细胞的生物学特性，并且在肺癌的发展中起着决定性的作用[6－7]。

很多基因在肿瘤干细胞中高度表达，并在维持肿瘤干细胞生物功能方面起着重要作用，例如Oct－4、Nestin、HGF、APC、CD44等。本研究以PCR方法总结了干细胞相关基因的差异表达水平，发现包括CD44、Oct－4、Nestin、APC、CDC2、HGF和TGF等基因在内的很多基因都在肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞中差异表达，而Oct－4和Nestin在很多肿瘤干细胞中呈共表达。Oct－4是一种重要的能够调节干细胞的自我更新能力和多潜能性的转录因子，尽管Oct－4被发现在一些成体的已分化细胞中表达[8]，但是它仍被认为是成体干细胞的一种生物学标记。Nestin是一种中间丝蛋白，它表达于神经元和正在成长的细胞中。Nestin还在滤泡干细胞中表达，并且起着调节细胞重塑、增生和分化、增殖的功能[9]。

笔者近来的研究提示，Nestin也许会是一个新的可能的肺癌肿瘤标志物。本文深入的研究了320例肺癌样本中Oct－4和 Nestin的表达情况，发现在其中42例样本中Oct－4和Nestin共表达。尤为惊人的是，通用多元分析显示，Oct－4和Nestin的共表达与起病年龄较小、淋巴结转移显著相关。COX回归分析提示，Oct－4和Nestin的共表达与肺癌预后不良亦有相关性。

综上所述，本研究显示，Oct－4和Nestin在肺癌干细胞中显著表达，并且其表达与肿瘤的病理分级、淋巴结转移情况和肺癌患者较短的生存期相关。提示Oct－4和Nestin也许在调节肺癌发展过程中起到了重要的作用。

[1]Fabrizi E，Di Martino S，Pelacchi F，et al.Therapeutic implications of colon cancer stem cells[J].World J Gastroenterol，2010，16：3871－3877.

[2]Ginestier C，Charafe－Jauffret E，Birnbaum D.Targeting breast cancer stem cells： fishing season open[J].Breast Cancer Res，2010，12：312.

[3]Liu R，Wang X，Chen GY，et al.The prognostic role of a gene signature from tumorigenic breast－cancer cells [J].N Engl J Med，2007，356：217－226.

[4]Monsef N，Soller M，Isaksson M，et al.The expression of pluripotency marker Oct 3/4 in prostate cancer and benign prostate hyperplasia[J].Prostate，2009，69：909－916.

[5]Park D，Xiang AP，Mao FF，et al.Nestin is required for the proper selfrenewal of neural stem cells[J].Stem Cells，2010，28：2162－2171.

[6]Grimshaw MJ，Cooper L，Papazisis K，et al.Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells[J].Breast Cancer Res，2008，10：R52.

[7]Guo J，Zhou J，Ying X，et al.Effects of stealth liposomal daunorubicin plus tamoxifen on the breast cancer and cancer stem cells [J].J Pharm Pharm Sci，2010，13：136－151.

[8]Cai J，Xie D，Fan Z，et al.Modeling co－expression across species for complex traits：insights to the difference of human and mouse embryonic stem cells[J].PLoS Comput Biol，2010，6：e1000707.

[9]Li H，Cherukuri P，Li N，et al.Nestin is expressed in the basal/myoepithelial layer of the mammary gland and is a selective marker of basal epithelial breast tumors[J].Cancer Res，2007，67：501－510.