二苯乙烯苷对C57BL/6J小鼠毛发生长影响的研究

张 焱，余 勇，吴立成

(1．金华职业技术学院医学院，浙江 金华 321017；2．金华市食品药品检验所，浙江 金华 321000)

·基础与临床研究·

二苯乙烯苷对C57BL/6J小鼠毛发生长影响的研究

张 焱1，余 勇1，吴立成2

(1．金华职业技术学院医学院，浙江 金华 321017；2．金华市食品药品检验所，浙江 金华 321000)

目的：探讨二苯乙烯苷对小鼠毛囊毛发生长周期及其小鼠触须毛囊体外培养的影响。方法将C57BL/6J小鼠分组，采用不同浓度的二苯乙烯苷灌胃以及培养液离体培养小鼠触须毛囊的方法，在给药后的不同时间观察各组小鼠毛发生长状况。结果二苯乙烯苷灌胃组中，50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组较对照组明显诱导C57BL/6J小鼠毛发生长，缩短小鼠皮肤变黑时间，早期加速小鼠毛发的生长速度，差异有统计学意义(P<0.05)，且100μg/ml组作用更明显(P<0.01)。二苯乙烯苷离体培养小鼠触须毛囊组中， 0.1mg/L、0.3mg/L组培养第8天毛囊毛发生长长度大于对照组和其他实验组。结论二苯乙烯苷具有明显的促进毛发生长作用。

C57BL/6J小鼠；毛发生长周期；二苯乙烯苷；毛囊体外培养

Abstract:[Objective] To discuss the effect of stilbene to growth cycle of hair and palp’s hair follicle culture in vitro in C57BL/6J mouse.[Method] Stilbene was used in C57BL/6J mouse in different concentration .The mouse were divided into two groups .Group one was practiced with administration by gavage . Group two was used culture solution to culture palp’s hair follicle. The two group’s hair growth situation were observed.[Result] In group one, 50mg/ml,100mg/ml and 150mg/ml stilbene can induce hair growth and shorten skin blacken time obviously . The difference is significant (P<0.05). Among the group, 100ug/ml stilbene’s effect was most obvious (P<0.01). In group two, 0.1mg/L,0.3mg/L stilbene can make hair follicle grow longer than comparison group after 8 day’s culture. [Conclusion] Stilbene can accelerate the growth of hair obviously.

Keywords: C57BL/6J mouse; growth cycle of hair; stilbene; hair follicle culture in vitro

脱发是临床常见疾病,脂溢性脱发、斑秃等脱发问题一直是临床治疗的难题。何首乌是临床上治疗斑秃的主要中药之一。现代药理学研究已表明，何首乌的主要活性成分二苯乙烯苷(2,3,5,4’-tetrahydroxystilbene-2-0-Beta-D-glucoside，THSG)具有抗衰老、降低胆固醇、提高免疫功能、防止动脉硬化及保护细胞等功效[1-2]，但是否对毛发具有生长作用以及通过何种途径发挥作用，国内外文献尚未见报道。我们以动物实验为基础，于2011年至2012年与金华市食品药品检验所合作研究探讨二苯乙烯苷对小鼠毛囊毛发生长及其小鼠触须毛囊体外培养的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8周龄的近交系C57BL/6J小鼠由金华市食品药品检验所提供，SPF级，雌性，体质量20～26g，选择鼠皮为粉红色、毛发处于休止期的小鼠。

1.1.2 二苯乙烯苷 参考戚爱棣[3]研究报道方法进行提取。

1.2 方法

1.2.1 小鼠体内灌服实验

1.2.1.1 实验分组：分为7组，每组6只小鼠。将松香与石蜡混合加热融化涂于小鼠背部，涂抹面积约3cm×4cm，冷却凝固后揭去，以去除背毛。确认休止期(小鼠背部皮肤呈粉红色)开始给药。

1.2.1.2 给药：对照组为阴性组，不灌服二苯乙烯苷；实验组分别把浓度为1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的二苯乙烯苷1ml灌入C57BL/6J小鼠体内，观察小鼠皮肤颜色变化和毛发生长情况。

1.2.1.3 观察记录：灌服后每天观察小鼠皮肤及毛色变化，记录每只小鼠背部去毛区的皮肤颜色从服药到开始变黑的时间(阴性对照组则记录小鼠皮肤从粉红色到开始变黑的时间)；从开始变黑到长满毛的时间以及开始变黑至开始变灰的时间。给药后第9天、18天，每组随机选择3只小鼠，处死, 取相同脱毛区皮肤,做常规石蜡切片和苏木素伊红(HE)染色，光学显微镜下进行组织形态学观察,并与对照组进行比较。继续观察余下小鼠皮肤颜色变化和毛发生长情况。

1.2.2 小鼠触须毛囊体外实验

1.2.2.1 小鼠触须毛囊器官培养的建立：6～8周龄的C57BL/6J小鼠(由金华市食品药品检验所提供)，断颈处死，立即剪去双侧胡须，用75%乙醇消毒上唇部3遍，无菌条件下剪取双侧胡须垫，置于D-Hanks液中，反复冲洗3遍后置于Williams培养液中，在立体解剖显微镜下用显微剪、镊分离出生长期毛囊，选取完整无损伤的生长早期毛囊减去上1/3部分。毛囊培养在96孔板(Costar公司)中进行，每孔仅放一个毛囊，每孔含Williams无血清培养液0.2ml，然后放进37℃、5%CO2的孵箱中培养。

1.2.2.2 实验分组：分为9组，每组8个毛囊，对照组Williams培养液中不加二苯乙烯苷。实验组分8组，在Williams培养液中加入二苯乙烯苷，使二苯乙烯苷的浓度分别为0.001mg/L、0.003mg/L、0.01mg/L、0.03mg/L、0.1mg/L、0.3mg/L、1mg/L、3mg/L。

1.2.2.3 观察记录毛发生长情况：培养的第1天至第8天，经倒置显微镜下通过目镜测微器每天测量自毛囊底部至毛发顶部的长度，将第8天与第1天的测量结果相减即为毛发生长长度，比较各组的毛发生长长度。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 皮肤颜色改变

与对照组比较，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组明显缩短了小鼠皮肤变黑时间，皮肤由黑色到长满毛的时间间隔也明显缩短，且100μg/ml组作用更明显(P<0．01)。对小鼠皮肤变灰时间, 各组间无显著差异。结果见表1。

表1 二苯乙烯苷灌胃对鼠毛发生长周期的影响

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

2.2 毛囊及毛细血管增长

给药第9天,二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组较对照组小鼠脱毛区毛囊较大, 数量较多，多数分布在真皮深层，而且真皮层小血管数量明显增多(图2A、2B)。给药第18天, 对照组小鼠脱毛区毛囊数量较少且缩短、扭曲, 真皮层小血管数量也较少(图2C)。二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组小鼠脱毛区毛囊数量增多明显, 且毛囊、毛乳头较大、生长旺盛，真皮层小血管数量也明显增多(图2D)。结果见表2。

表2 二苯乙烯苷灌胃对鼠脱毛区皮肤毛囊数和小血管数的影响

与对照组比较:*P<0.05，**P<0.01

A 第9天对照组毛囊较小，位于真皮和皮下组织交界，血管少

2.3 毛发生长长度

培养第8天各组小鼠毛囊毛发平均生长长度见表3。二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L组的毛发生长长度大于对照组，其余各组和对照组之间的毛囊毛发生长长度差异无统计学意义。

表3 二苯乙烯苷小鼠触须毛囊生长的影响

与对照组比较:*P<0.05 ，**P<0.01

3 讨论

本实验选择6～8 周的C57BL/6J小鼠，其所有毛囊已由生长期进入静止期, 生理状态下不再自发进入生长期，需经人工脱毛或者拔毛等刺激后，诱导其毛发进入生长期, 并可自发经过退行期再进入休止期。此周期活动与自然周期相比无明显差异[4]。小鼠躯干皮肤黑色素细胞只存在于毛囊中，且仅在生长期时合成黑色素并传递给角质形成细胞使皮肤变为黑色。至退行期，黑色素生成减少，皮肤变成灰色，休止期皮肤再变为粉红色。因此，可以根据小鼠皮肤颜色来大致判断其毛发生长周期情况[5]。

我们采用二苯乙烯苷作为实验药物，采用灌胃给药和小鼠触须毛囊体外培养的方法，研究二苯乙烯苷对C57BL/6J小鼠毛囊毛发生长周期的影响。肉眼观察结果发现，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组较对照组小鼠的背部皮肤颜色由粉红色转变为黑色的时间缩短，显示提前由休止期进入生长期(P<0.05)，差异有统计学意义。进人生长期后这几组小鼠的毛发生长速度也明显快于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义，且100μg/ml组作用更明显(P<0.01)。组织学检查结果与肉眼观察的皮肤颜色变化一致，二苯乙烯苷灌胃50μg/ml、100μg/ml组和150μg/ml组能明显增加皮肤毛囊数及毛囊毛细血管数量，从而营养毛囊, 使毛囊变多、变粗，达到加快毛发生长的作用。其余剂量组则与对照组相比无差异。小鼠触须毛囊体外实验结果显示二苯乙烯苷0.1mg/L、0.3mg/L组的毛发生长长度大于对照组(P<0.05)，差异有统计学意义。研究结果表明，适量的二苯乙烯苷无论灌胃还是体外培养均能诱导C57BL/6J小鼠毛发生长，促进C57BL/6J小鼠毛发由休止期向生长期转变，明显缩短小鼠皮肤变黑时间，能加速小鼠毛发在生长期早期的生长，但对毛发生长周期无明显影响。其作为生发药物作用机制还有待于进一步研究。

[1]张彩平,杨滢,田英,等. 二苯乙烯苷对 H2 02 诱导血管内皮细胞黏附分子表达的影响[J]. 中国药理学通报,2012,28 (8):1088-1092.

[2]李彩蓉,蔡飞,黎荣,等.二苯乙烯苷对高糖诱导系膜细胞衰老相关信号的调节作用[J].中国药理学通报,2010,26 (2):272-273.

[3]戚爱棣. 何首乌中二苯乙烯苷提取工艺优选及炮制对其含量的影响[J].中草药,2002,33 (7):609.

[4]Paus R, Handjiski B, Czarnetzki BM, et al. A murine model for inducing and manipulating hair follicle regression ( catagen) : effects of dexamethasone and cyclosporin A [J]. J Invest Dermatol , 1994, 103(2) : 143-147.

[5]Slominski A, Paus R. Melanogenesis is coupled to murine anagen: toward new concepts for the role of melanocytes and the regulation of melanogenesis in hair growth [J]. J Invest Dermatol, 1993, 101( 1 Suppl ) : 90S-97S.

TheeffectofstilbenetogrowthcycleofhairinC57BL/6Jmouse

ZHANGYan1,YUYong1，WULicheng2

(1．Jinhua Polytechnic Medical College，Zhejiang 321017 ，China；2．Jinhua City Food and Drug Inspection Institute,Zhejiang 321000,China)

R758.71

A

1672-0024(2013)02-0038-04

金华市科技计划项目(编号：2007-3-060)