高丽参治疗睾丸缺血再灌注损伤的实验研究

韦思明，颜志中，周 剑

(1. 浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003；3. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

·基础与临床研究·

高丽参治疗睾丸缺血再灌注损伤的实验研究

韦思明1，颜志中2，周 剑3

(1. 浙江医学高等专科学校，浙江 杭州 310053；2. 杭州市红十字会医院，浙江 杭州 310003；
3. 浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州 310006)

目的：睾丸扭转复位后的损伤是一个缺血再灌注损伤。本研究探讨高丽参治疗睾丸缺血再灌注损伤的功效。方法60只成年雄性SD大鼠被随机分为3组。对照组接受了左侧睾丸假手术。扭转复位组经受了左侧睾丸扭转，2小时后复位。治疗组接受了同扭转复位组一样的外科手术，但给予高丽参口服治疗。复位后4小时或3个月，行左侧睾丸切除术，分析睾丸中丙二醛水平(活性氧标志)、环磷酸腺苷反应元件调控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)的表达和睾丸生精功能。结果睾丸扭转复位引起睾丸丙二醛水平显著升高，CREM表达和生精功能明显降低。高丽参治疗显著降低了睾丸丙二醛水平，明显提高了CREM表达和生精功能。结论高丽参对睾丸缺血再灌注损伤具有明显的保护效应。该效应可能与减少活性氧产生、提高CREM表达有关。

高丽参;睾丸扭转复位;缺血再灌注损伤

Abstract:[Objective] The damage after testicular torsion-detorsion (TTD) is an ischemia-reperfusion injury. This study investigated the effect of Korean ginseng (KG) on testicular ischemia-reperfusion injury. [Method] 60 adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups. Control group received a sham operation of left testis. TTD group underwent 2 hours of left testicular torsion. Treatment group underwent same surgical procedure as TTD group, but KG was given orally. Left orchiectomy was performed 4 hours or 3 months after detorsion to measure malondialdehyde(a mark of reactive oxygen species), cAMP-responsive element modulator (CREM) expression and spermatogenic function. [Result] TTD caused a significant increase in malondialdehyde level and significant decreases in CREM expression and spermatogenic function. The rats treated with KG had a significant decrease in malondialdehyde level and significant increases in CREM expression and spermatogenic function. [Conclusion] KG protects testes from ischemia-reperfusion injury. The protective effect of KG may be related to decrease of reactive oxygen species production, and improvement of CREM expression.

Keywords: Korean ginseng; testicular torsion-detorsion; ischemia-reperfusion injury

睾丸扭转又称精索扭转，它是泌尿外科急症，是指精索沿其纵轴旋转，精索内血液循环产生障碍，导致睾丸缺血甚至坏死。在25岁以下的男性发生率为1/4000，因此本病并非少见[1]。通过手术复位是治疗睾丸扭转的现有方法，可以避免睾丸因缺血而坏死。睾丸复位后即使存活，但患者随后出现了睾丸萎缩，生精功能损伤[1]。睾丸扭转复位后的损伤是一个典型的缺血再灌注损伤，目前缺乏相应的临床辅助治疗，所以手术后的临床辅助治疗已成为研究的重要方向之一。本研究通过建立大鼠睾丸扭转复位模型，探讨高丽参在睾丸缺血再灌注损伤中的保护作用，为更好地进行临床治疗提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

成年雄性SD大鼠(250～300g)购于上海实验动物中心。高丽红参购自杭州华东大药房连锁有限公司。丙二醛测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。兔抗鼠环磷酸腺苷反应元件调控因子(cAMP-responsive element modulator, CREM)抗体和化学发光检测试剂由Santa Cruz公司生产。带辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。内参β-肌动蛋白(β-actin)抗体购自Sigma公司。

1.2 高丽参溶液的制备[2]

300g高丽参在6升沸水中煮2小时，过滤，取滤液冻干。冻干粉76.6克，得率26%，4℃保存。每次实验前，将干粉溶解在去离子的蒸馏水中作为高丽参溶液。

1.3 大鼠睾丸扭转复位模型的制作及其治疗

60只成年雄性SD大鼠随机分为3组，每组20只。将氯胺酮以每公斤体重50mg的剂量注入大鼠腹腔麻醉。对照组大鼠：通过左侧髂腹股沟切口取出左侧睾丸，用11/0无创伤缝线穿过睾丸白膜。然后，睾丸通过原切口放入阴囊，切口缝合关闭。扭转复位组大鼠：通过同样的切口暴露左侧睾丸，将左侧睾丸绕精索逆时针扭转720°，睾丸白膜与阴囊肉膜之间用11/0无创伤缝线缝合固定，防止睾丸自发复位，缝合切口。2h后，再次打开切口，将睾丸反方向旋转复位，睾丸恢复血供，仍然存活，放睾丸入阴囊，关闭切口。治疗组大鼠：也行同样的左侧睾丸扭转复位术，但在复位的时候将溶解在水里的高丽参以每公斤体重1.0g的剂量灌胃[2]。复位后4h，每组半数的大鼠被处死，行左侧睾丸切除术，测定睾丸中丙二醛水平。在治疗组，剩下的大鼠继续给予高丽参(1.0 g/kg/d)灌胃，连续3个月。复位后3个月，每组剩余的大鼠行左侧睾丸切除术，分析睾丸中CREM蛋白表达和睾丸生精功能。

1.4 丙二醛水平的测定

用硫代巴比妥酸法测定睾丸中丙二醛水平, 操作步骤按照试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书进行。

1.5 Western blot检测睾丸中CREM蛋白表达

睾丸组织在裂解缓冲液中被搅拌成组织匀浆， 4℃离心15min，取上清液，用Bradford法检测蛋白浓度。样品(含20μg蛋白)在100℃加热3min使蛋白变性，然后上样，在10%SDS-PAGE胶上电泳，转膜，37℃封闭1h，加入兔抗鼠CREM抗体，4℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体，常温孵育1h，ECL显示膜上蛋白条带。用GS-700型图像密度测量仪及其分析软件(Bio-Rad Laboratories公司产品)测定条带密度。CREM条带与内参照β-actin条带的密度比值代表CREM蛋白的相对表达水平。

1.6 睾丸生精功能的分析

通过测定睾丸的重量和每日精子产量来分析睾丸生精功能。左侧睾丸切除后立即称重，在50ml含有0.154M氯化钠、0.5%聚乙二醇辛基苯基醚、2%叠氮钠、伊红溶液中搅拌成匀浆。用血细胞计数板测定浓缩的精子细胞核数目，结果作为每日精子产量。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 4.0软件处理数据。实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析和q检验，以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 睾丸丙二醛水平

表1显示：扭转复位组的丙二醛水平明显高于对照组(P<0.05)；治疗组的丙二醛水平明显低于扭转复位组，但仍高于对照组(P<0.05)。

表1 各组睾丸中丙二醛、CREM蛋白、睾丸重量和每日精子产量的检测结果

注： ▲：与对照组比较P< 0.05; ◆：与扭转复位组、对照组比较P< 0.05

2.2 睾丸中CREM蛋白的表达

表1和图1显示：扭转复位组的CREM表达明显低于对照组(P<0.05)；治疗组的CREM表达明显高于扭转复位组，但仍低于对照组(P<0.05)。

图1 Western blot检测各睾丸中CREM蛋白的表达

2.3 睾丸的生精功能

表1显示：扭转复位组睾丸重量和每日精子产量明显低于对照组(P<0.05)；治疗组睾丸重量和每日精子产量明显高于扭转复位组，但仍低于对照组(P<0.05)。

3 讨论

睾丸扭转是一个常见的泌尿科急诊。如果睾丸扭转在6小时内不治疗，睾丸将发生梗死[1]。但是，即使睾丸扭转患者在这个时间内接受了外科复位手术，睾丸也将丧失正常的生精功能[1]。在我们的动物实验中，大鼠经受了2小时的睾丸扭转，复位后睾丸仍然存活，但睾丸生精功能严重受损，包括睾丸重量和每日精子产量显著下降。然而，睾丸损伤的机制尚不清楚。

环磷酸腺苷反应元件调控因子(cAMP responsive elemental modulator , CREM)是属于碱性域/亮氨酸拉链转录因子类，它在大多数组织中都低水平表达，而在成年男性睾丸组织中其表达水平是其它组织的一百倍,它是控制雄性生殖细胞分化和凋亡的总开关[1]。突变小鼠CREM基因使蛋白表达减少或缺失，导致小鼠睾丸重量减轻20%～25%，精液中精子数量减少46%[3]。CREM的表达对精子发育成熟必不可少。在我们的研究中，睾丸扭转复位引起睾丸CREM表达明显减少，睾丸生精功能也严重受损，包括睾丸重量和每日精子产量明显下降。由于CREM表达对精子发育成熟必不可少，所以我们推测：CREM表达的降低可能是导致睾丸生精功能损伤的原因。高丽参的主要成分是人参皂苷，它拥有广泛的药理作用，如抗氧化，抗衰老，抗应激，等[4]。因此，高丽参在亚洲已经被应用几千年治疗各种疾病，如冠心病，高血压，糖尿病，肿瘤，等。据Park等人报道，高丽参通过增加CREM表达来提高睾丸生精功能[2]。因此，我们尝试用高丽参治疗睾丸扭转复位所诱导的损伤。结果显示：相比于扭转复位组，治疗组睾丸CREM表达明显升高，睾丸生精功能亦显著提高。这表明高丽参通过提高CREM表达来减轻睾丸的损伤。在治疗过程中我们没有发现明显的副作用，说明高丽参治疗是安全的。但是，高丽参提高CREM表达的机制仍然未知。

睾丸扭转复位是一个典型的缺血再灌注过程，在这一过程中产生了大量活性氧，如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基。缺血组织细胞内的次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶反应是活性氧产生的一个重要途径[5]。因为活性氧半衰期很短，很难直接测定，通常用活性氧引起细胞脂质过氧化产物丙二醛来间接表示活性氧水平[6]。我们的研究显示：扭转复位组睾丸的丙二醛水平明显高于对照组，这提示睾丸扭转复位后活性氧大量产生。活性氧可以通过改变基因表达来引起细胞的损伤[1]。因此，我们推测：睾丸扭转复位后，活性氧的大量产生可能是引起CREM表达降低的原因。据报道，高丽参可以通过抑制黄嘌呤氧化酶活性来减少活性氧产生[7]。在我们的研究中，高丽参治疗显著降低了活性氧含量，明显提高了CREM表达。这结果证实了活性氧是引起CREM表达降低的原因，也意味着：高丽参通过减少活性氧的产生来提高CREM表达。结合前面的结论：高丽参通过提高CREM表达来减轻睾丸的损伤，我们认为，高丽参通过减少活性氧的产生来提高CREM表达，从而保护睾丸的生精功能。

我们使用的高丽参剂量(1.0 g/kg/d)参考了Park等人的报道[2]，与扭转复位组相比，治疗组的这个剂量显著降低了丙二醛水平，提高了CREM表达和生精功能，但治疗后丙二醛水平、CREM表达和生精功能仍然没有恢复到正常水平，这可能与药物剂量有关，需要进一步研究来确定最佳治疗剂量。

总之，我们证实了高丽参对睾丸缺血再灌注损伤具有明显保护作用，并对其作用机制进行了探讨，这将为临床治疗提供了一定的实验依据。

[1]Wei SM, Yan ZZ, Zhou J. Role of cAMP-responsive element modulator-tau (CREMtau) in ipsilateral testicular injury after unilateral testicular torsion-detorsion [J]. Fertil Steril, 2008, 89(6):1737-1742.

[2]Park WS, Shin DY, Kim do R, et al.

Korean ginseng induces spermatogenesis in rats through the activation of cAMP-responsive element modulator (CREM) [J]. Fertil Steril，2007，88(4):1000-1002.

[3]Nantel F, Monaco L, Foulkes NS, et al. Spermiogenesis deficiency and germ-cell apoptosis in CREM-mutant mice [J]. Nature, 1996, 380(6570):159-162.

[4]Kim CS, Park JB, Kim KJ, et al. Effect of Korea red ginseng on cerebral blood flow and superoxide production [J].Acta Pharmacol Sin, 2002,23(12):1152-1156.

[5]金惠铭.病理生理学[M].第四版.北京：人民卫生出版社，2000.147-148.

[6]王迪浔.病理生理学[M].北京：人民卫生出版社，1994.366-381.

[7]Wei X, Su F, Su X, et al. Stereospecific antioxidant effects of ginsenoside Rg3 on oxidative stress induced by cyclophosphamide in mice [J]. Fitoterapia, 2012,83(4):636-640.

Experimentalstudyoftesticularischemia-reperfusioninjurytreatedwithKoreanginseng

WEISiming1,YANZhizhong2,ZHOUJian3

(1. Zhejiang Medical College, Hangzhou310053,China；2. Red Cross Hospital of Hangzhou City, Hangzhou 310003, China；3. The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310006, China)

韦思明(1971-)，男，浙江杭州人，博士，副教授。研究方向：泌尿外科学

浙江医学高等专科学校博士科研启动基金资助项目(编号:2008B05)

R697.22

A

1672-0024(2013)02-0035-04

作者简介：张 焱(1973-)，女，浙江金华人，本科，副主任护师 。研究方向：老年护理